鸡源益生菌的分离、筛选、鉴定与特性研究

鸡源益生菌的分离、筛选、鉴定与特性研究

姓名：陈琼申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：杨汝德

20040501

摘要摘要本研究课题来源于广东省农业攻关项目“安全高效无残留的新型畜禽用微生态制剂的研制与应用”，文件编号为粤科技字［２００２］１４１号。本实验内容是该项目的一部分，主要研究了从鸡的肠道中分离筛选出五种肠道菌，初步鉴定为肠道益生菌，在此基础上对各菌株的发酵特性进行探讨，并对各菌株拮抗致病菌和抗生素进行了探讨。同时也探讨了筛选出的菌株间的拮抗性及相容性。选用Ｂｓ培养基，从１５天龄小鸡的盲肠中分离筛选出双歧杆菌。选用ｓＬ培养基，从ｌＯ天龄小鸡的小肠中分离筛选出乳酸杆菌。选用Ｅｃ培养基，从３０天龄小鸡的盲肠中分离筛选出屎肠球菌。选用ＢＬＩ培养基，从３０天龄小鸡的盲肠中分离筛选出地衣芽孢杆菌。选用麦芽汁培养基，从成年鸡的盲肠中分离筛选出酵母菌。对分离筛选获得的五种菌株进行初步鉴定：菌株Ｂ１７ｌ是双歧杆菌，菌株Ｍ１６是嗜酸乳杆菌，菌株ｗ０１９是屎肠球菌，菌株ＹＢ０２是地衣芽孢杆菌，菌株Ｂ１２ｌ是酵母菌。双歧杆菌ＢＬ７１为革兰氏阳性严格厌氧菌，最佳培养条件是初始ｐＨ值７．０，最适培养温度为４０℃。采用正交实验方法，确定最佳培养基配方为酵母膏０．９％．胰蛋白胨０．６％，大豆蛋白胨０．６％，葡萄糖２．５％，双歧因子０．２％，生氏因子ｌＯ％。发酵培养时间１８ｈ。在最佳培养条件下，Ｂ１７１的增殖菌数可达６．２×１０８个／ｍＬ。嗜酸乳杆菌Ｍ１６为革兰氏阳性兼性厌氧菌，发酵培养时间１６ｈ，增殖菌数可达７。ｌ×１０８个／ｍＬ。屎肠球菌ｗＯｌ９为革兰氏阳性兼性厌氧菌，发酵培养时间１６ｈ，增殖菌数可达８．３×１０ｓ／ｍｌ。地衣芽孢杆菌ＹＢ０２为革兰氏阳性好氧菌，其最佳培养条件为初始ｐＨ值６．５，最适培养温度３０～３２℃。采用正交实验方法，确定最优培养基为酵母膏１．５％，玉米淀粉２．０％，Ｎａｉｌ２Ｐ０４＋Ｎａ２ＨＰＯ４０．２％＋Ｏ．２％，玉米浆２．０％。发酵培养时间１８～２０ｈ，此时增殖菌数可达３．５×１０９个／ｍＬ。酵母菌Ｂ１２ｌ的发酵培养时间为１８～２０ｈ，此时增殖菌数可达１．２４×１０８个／ｍＬ。拮抗病原菌实验表明，嗜酸乳杆菌Ｍ１６的代谢产物在体外具有抑制杀灭鸡大肠埃希氏菌Ｏ一７８，鸡白痢沙门氏菌Ｏ一７９，金黄色葡萄球菌Ｃ５８０００的作用。双歧杆菌Ｂ１７１和屎肠球菌Ｗ０１９对三种致病菌均有明显的抑制作用。地衣芽孢杆菌ＹＢ０２对鸡大肠埃希氏菌Ｏ一７８有抑制作用，对鸡白痢沙门氏菌０—７９，金黄色葡萄球菌Ｃ５８０００有拮抗作用。酵母菌Ｂ１２ｌ对三种致病菌有拮抗作用。拮抗抗生素实验表明，双歧杆菌Ｂ１７ｌ对丁胺卡那霉素、新霉素、巴龙霉素有华南理工大学硕士学位论文耐药性，对青霉素、万古霉素、林可霉素和杆菌肽敏感。乳酸杆菌Ｍ１６对丁胺卡那霉素、新霉素、坏丙沙星有耐药性，对林可霉素、庆大霉素敏感。屎肠球菌ｗｏｌ９对林可霉素、丁胺卡那霉素有耐药性．对庆大霉素、万古霉素、氨卞青霉素敏感。地衣芽孢杆菌ＹＢ０２对林可霉素、磺胺嘧啶有耐药性，对庆大霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星、氨卞青霉素、新霉素敏感。酵母菌Ｂ１２ｌ对环丙沙星、林可霉素、新霉素、杆菌肽有耐药性。双歧杆菌Ｂ１７１、嗜酸乳杆菌Ｍ１６、屎肠球菌ｗ０１９、地衣芽孢杆菌ＹＢ０２、酵母菌Ｂ１２ｌ之间相互没有拮抗作用。关键词益生菌；小鸡：分离筛选：动物微生态制剂——一垒呈！！垦垒￡！ＡＢＳＴＲＡＣＴＴｈｉｓｓｔｕｄｙｃａｍｅｆｒｏｍｔｈｅｋｅｙｐｒｏｊｅｃｔｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ．Ｔｈｅｐｒｏｊｅｃｔ，ｎｕｍｂｅｒｅｄｙｕｅｋｅｊｉ［２００２］１４１，ｗｏｒｅ“ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｅｃｏＩｏｇｉｃｓｆｏｒａｎｉｍａｌｓｗｈｉｃｈｓａｆｅ，ｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｎｄｎｏｎ—ｒｅｍａｉｎｅｄ．”Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｏｎｅｐａｒｔｏｆｔｈｉｓｐｒｏｊｅｃｔ．Ｔｈｅｍａｊｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｗｅｒｅｆｏｌｌｏｗｓ：Ｆｉｖｅｋｉｎｄｓｏｆｓｔｒａｉｎｓｗｈｉｃｈｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｅｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｓｃｒｅｅｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔｏｆｈｅａｌｔｈｙｃｈｉｃｋｅｎ．ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｆｉｖｅｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ，ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＥｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎ，ｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｓｅｓｔｒａｉｎｓｗａｓａｌｓｏｓｔｕｄｉｅｄ，ａｎｄｔｈｅａｎｔａｇｏｎｉｓｍａｍｏｎｇｔｈｅｓｅｆｉｖｅｓｔｒａｉｎｓｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄ．ＵｓｉｎｇＢＳｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｕｌｌｏｒｕｍｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅａｐｐｅｎｄｉｘｏｆｆｉｆｔｅｅｎ—ｄａｙ—ｏｌｄｃｈｉｃｋｅｎ．ＵｓｉｎｇＳＬｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅｏｆｔｅｎ—ｄａｙ・ｏｌｄｃｈｉｃｋｅｎ．ＵｓｉｎｇＥＣｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉｆａｅｌｉｓｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅａｐｐｅｎｄｉｘｏｆｔｈｉｒｔｙ・ｄａｙ・ｏｌｄｃｈｉｃｋｅｎ．ＵｓｉｎｇＢＬＩｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅＢａｃｉｔｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅａｐｐｅｎｄｉｘｏｆｔｈｉｒｔｙ－ｄａｙ—ｏｌｄｃｈｉｃｋｅｎ．Ｕｓｉｎｇｗｏｒｔｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅＹｅａｓｔｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅａｐｐｅｎｄｉｘｏｆｔｈｉｒｔｙ—ｄａｙ—ｏｌｄｃｈｉｃｋｅｎ．ＴｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｓｔｒａｉｎＢ１７１ｗａｓＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｕｌｌｏｒｕｍ，ｓｔｒａｉｎＭ１６ｗａｓＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，ｓｔｒａｉｎＷ０１９ｗａｓＥｎｔｅｒｏｅｏｃｃｉｆａｅｌｉｓ，ｓｔｒａｉｎＹＢ０２ｗａｓＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ．ｓｔｒａｉｎＢ１２１ｗａｓＹｅａｓｔ．Ｂ１７１ｗａｓａｎａｅｒｏｂｉｃ．Ｇｒａｍ—ｐｏｓｉｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅ：ｐＨｖａｌｕｅｏｆｍｅｄｉａ７．０，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ４０。Ｃ．Ｕｓｉｎｇｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙｔｅｓｔ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆｏｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆ０．９％ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ．０．６％ｔｒｙｐｔｏｎｅ，Ｏ．６％ｓｏｙａｐｅｐｔｏｎｅ，２，５％ｇｌｕｃｏｓｅ，０．２％ｂｉｆｉｄｕｓ，ｔ０％ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ．Ｔｈｅｔｅｒｍｉｎａｌｔｉｍｅｗａｓａｔｉ８ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｂｉｏｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｂｔａｉｎｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗａｓ６．２ｘｔ０８／ｍＬ．Ｍ１６ｗａｓａｎａｅｒｏｂｉｃ．Ｇｒａｍ—ｐｏｓｉｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅｔｅｒｍｉｎａｌｔｉｍｅｗａｓａｔ１６ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｂｉｏｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｂｔａｉｎｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗａｓ７．１ｘ１０８／ｍＬ．Ｗ０１９ｗａｓａｎａｅｒｏｂｉｃ，Ｇｒａｍ・ｐｏｓｉｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅｔｅｒｍｉｎａｌｔｉｍｅｗａｓａｔ１６ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｂｉｏｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｂｔａｉｎｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗａｓ８．３ｘ１０５／ｍＬ．ＹＢ０２ｗａｓａｅｒｏｂｉｃ，Ｇｒａｍ—ｐｏｓｉｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅ：ｐＨｖａｌｕｅｏｆｍｅｄｉａｗａｓ６．５．ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ３０～３２℃．Ｕｓｉｎｇｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙｔｅｓｔ．ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆｏｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆ１．５％ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，２．０％ｃｏｒｎｓｔａｒｃｈ，０．２％＋Ｏ．２％ＮａＨ２Ｐ０４＋Ｎａ２ＨＰ０４，２．０％ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ．Ｔｈｅｔｅｒｍｉｎａｌｔｉｍｅｗａｓａｔ１８～２０ｈｏｕｒｓ．ＴｈｅｈｉｇｈｅｓｔｂｉｏｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｂｔａｉｎｅｄＩＩｌｆ＃南理ｒ．大学硕士学位论文ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗａｓ３．５ｘ１０９／ｍＬ．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔＯｔｈｅｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆＢ［２ｌ，ｔｈｅｔｅｒｍｉｎａｌｔｉｍｅｗａｓａｔ１８～２０ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｂｉｏｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｂｔａｉｎｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗａｓ１．２４ｘ１０８／ｍＬ．ＭＬ６ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｅｒａｂｏｌｉｔｅｏｆｃｏｕｌｄｄｅｓｔｒｏｙｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＥ．ｃｏｌｉ０－７８，ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｐｕｌｌｏｒｕｍＯ．７９ａｎｄＳ．ａｕｒｅｕｓＣ５８０００ｉｎｖｉｔｒｏ．ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＥｎｔｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｈａｄｂｅｅｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＢ１７ｌａｎｄＷ０１９ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆ０－７８ｈａｄｂｅｅｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＹＢ０２．ＹＢ０２ｈａｄａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｎｔｈｅＯ・７９ａｎｄＣ５８０００．ＡｎｄＢ１２ｌｈａｄａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｎ０－７８，Ｏ一７９ａｎｄＣ５８０００．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｅｓｔ．Ｂ１７ｌｈａｄｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔＯａｍｉｋａｃｉｎ，ｎｅｏｍｙｃｉｎ，ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄｗａｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎａｎｄｔＯｔＯｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ，ａｍｉｋａｃｉｎ．ｎｅｏｍｙｃｉｎ，ｈａｄｂａｃｉｔｒａｃｉｎ．Ｍ１６ｗａｓｈａｄｔｏｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎａｎｄｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ａｎｄｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔＯｓｅｎｓｉｔｉｖｅｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ．Ｗ０１９ｔＯｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎａｎｄａｍｉｋａｃｉｎ，ｗａｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎａｎｄａｍｐｏｃｉｌｌｉｎ．ＹＢ０２ｈａｄｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎａｎｄｓｕｌｆａｄｉａｚｉｎｅ，ａｎｄｗａｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔＯｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，ａｍｉｋａｃｉｎ，ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｓｕｌｆａｄｉａｚｉｎｅ，ｎｅｏｍｙｃｉｎ．Ｂ１２ｌｈａｄｄｒｕｇ・ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＴｈｅｒｅｈａｓｔＯｎｏｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎ，ｎｅｏｍｙｃｉｎａｎｄｂａｃｉｔｒａｃｉｎ．ａｎｔａｇｏｎｉｓｍａｍｏｎｇＢ１７ｌ，Ｍ１６，Ｗ０１９，ＹＢ０２ａｎｄＢ１２Ｉ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ；ｃｈｉｃｋｅｎ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｍｉｃｒｏｅｃｏＩｏｇｉｃｓｆｏｒａｎｉｍａｌｓ＼华南理工大学＼学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：健菇、日期：＾孵年ｇ月，名日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于保密口，在一年解密后适用本授权书。不保密叼。（请在以上相应方框内打“４”）作者签名：豫话、日期：训年占月嵋日。导师签名：／／物泓缇、１Ｕｒ、’日期：弦矿降矿月９日／第一章绪论第一章绪论１．１概述１．１．１动物微生态与动物微生态学１．１．１．１动物微生态在动物胃肠道的微生态系统中，微生物之间及微生物和宿主之间存在着错综复杂而又相对稳定的关系，动物胃肠道内的微生物群落的组成取决于微生物与宿主动物之间的交互作用，宿主为微生物提供栖息的环境，而微生物又提高了对有害细菌感染（尤其是胃肠道的感染）的抵抗能力ｍ。随着对动物胃肠道微生物群落研究的进一步深入，人们对胃肠道微生物的种类也有了较多的了解。胃肠道微生物按其在肠道内生存并定居的时间长短可以分为固定群落（ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕＳ或ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ）和过路群落（ａｌｌｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ或ｔｒａｎｓｉｅｎｔ），前者是指在胃肠道占有特定区域的微生物，后者则指那些不能在健康动物胃肠道内长时间滋生的微生物。也可将胃肠道内的微生物群落分成共生性细菌、机会性细菌和致病性细菌。共生性细菌是动物肠道的主要菌群（＞９０％），包括球菌、丙酸菌、乳酸菌及双歧杆菌等。这类细菌有利于宿主，细菌将负责的碳水化合物（纤维素或非淀粉多糖）发酵成为乳酸或挥发性脂肪酸（如丙酸），乳酸在肠道形成酸性环境对其他致病菌可产生“竞争排除作用”，但乳酸堆积过多也会刺激肠道蠕动，使肠道内容物排空加快。机会性细菌约占ｌＯ％，包括无病原性的大肠杆菌、链球菌及肠球菌等。这类细菌视肠道环境丽改变停留在肠道的数量及时间。致病性细菌的含量极少（＜０．０１％），包括梭菌、葡萄球菌、伪单胞菌、病原性大肠杆菌、曲型菌及部分真菌。这类菌群不仅具有致病性，同时会消耗宿主的能量，而其发酵产物（如ＮＨ。、Ｈ：Ｓ等）也可能对宿主有害。亦可以将肠道微生物分为需氧微生物、兼性厌氧微生物和厌氧微生物三大类ｗ。在动物正常肠道微生态系统中优势菌群为厌氧菌，占９９％以上，兼性厌氧菌和好氧菌不到的１％［２１。应该说对动物胃肠道内微生物的研究重点最初是在粪便中的微生物，但是现在则侧重于研究那些进入胃肠道内容物和肠道不同区段与上皮粘膜相关联的微生物。研究３种成年动物粪便中微生物区系的组成（见表ｉ—１），发现肠道内相对稳定的微生物群落的形成有助于动物提高抵抗力，免受外来有害细菌的感染，特别是对正常健康动物的胃肠道的感染，无菌动物比具有完整胃肠道微生物群落的动物更易感染疾病¨－。正因为动物胃肠道内微生物群落在增强动物机体抵抗力、调节胃肠道生态环境以及有利于动物对营养物质的消化与吸收等方面的特殊功效，围绕这些功效开展深入研究后，由Ｄｕｂｏｓ于１９６５年首先提出了动物胃肠道微生态学的概念，随后Ｓａｚａｇｅ对于Ｄｕｂｏｓ提出的概念进行了修改。国内康白于１９８８年正式提出了微．．华南理工人学硕士学位论文生态学的概念与理论ｔ。Ｉ。表ｔ—ｌ３种不同成年动物粪便微生物区系组成（ＬｏｇＣＦＵ・ｇ－Ｌ）Ｔａｂｔｅ卜ｌ～ｌｉｃｒｏｂｉａｔｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎｆａｃｅｓｏｆｃｈｉｃｋｅｎ，Ｐｉｇａｎｄｄｏｇ（ＬｏｇＣＦＵ・９１）微生物类别鸡猪狗１．１１２鸡肠道菌群的特点从雌鸡出壳至成年鸡，肠道菌群变化呈现一定的规律性。出壳后不久，肠道内即可检出链球菌和肠球菌。采食后第三天乳杆菌在十二指肠内迅速增殖，到７同龄时小肠菌群已基本形成。１３日龄时盲肠开始出现双歧杆菌、拟杆菌、真细菌和消化球菌，到２５目龄时盲肠菌群也基本建立。成年鸡的嗉囊中以乳杆菌为最优势菌群，链球菌和肠杆菌也不少。小肠菌群的构成与嗦囊相似，也以乳杆菌占绝对优势。盲肠中主要菌群为专性厌氧菌：双歧杆菌、拟杆菌、真细菌、消化球菌和梭菌，其次为链球菌、乳杆菌和肠杆菌。鸡的大肠很短，肠道菌群主要在盲肠内”ｑｌ。１．１１．３动物微生态学及其四个主要理论动物微生态学定义为研究动物体内微观环境中的正常微生物及其与宿主相互２第一章绪论关系的微生态学分支。动物微生态学理论主要包括动物胃肠道内的微生态平衡理论、微生态失调理沦、微生态营养理论和微生态防治理论［１ｌ。微生态平衡理论是指动物胃肠道内正常微生物群落与动物机体本身之间以及微生物群落之间，在长期的进化与演变过程中形成的相互依赖、相互制约的一种生理性微生态平衡状态。这些微生物群落能在动物胃肠道内生存并生长，能耐受种种不良环境及抗菌物质，并且能避免在动物肠道蠕动时被排出体外，可见在动物胃肠道内的正常微生物群落具有很强的自我与竞争性排异能力ｗ。相对而言‘，动物微生态失调理论则指正常的动物微生态平衡在外界环境的影响下，由生理性微生态平衡状态转变为病理性微生态失调状态，这些外界环境因素主要指抗生素、激素、药物和同位素的使用以及疾病感染等ｗ。何明清研究发现，正常仔猪的小肠内需氧菌与厌氧菌之比为ｌ：１００，而腹泻下痢时需氧菌与厌氧菌之比为ｌ：ｌ，即仔猪下痢时大肠杆菌等需氧菌的数量显著上升，乳杆菌等厌氧菌的数量却明显下降，也就是由于肠道微生物群落的微生态平衡被打破，致使仔猪发生了病理学下痢［９１。动物微生态营养理论则是指动物机体内正常微生物群落对其宿主的营养作用，即这些微生物既可直接参与物质代谢，为动物机体提供营养物质和生长刺激因子，又可提高动物机体的抵抗力，促进动物机体对营养物质的消化与吸收¨｜。Ｔｏｒｒａｌｌａｒｄｏｎａ：：ｏ／等发现，猪肠道微生物可以合成氨基酸并被动物吸收利用”Ｉ。动物微生态防治理论即指依据动物胃肠道微生态系统的客观规律，因势利导，改善胃肠道微生态环境，建立生物量更高的微生态平衡，起到防治疾病和促进动物生长之功效¨｜。１．１．２饲用抗生素局限性和负面效应动物微生态制剂的起源，可以说起因于抗生素的广泛使用。近１０年来，由于科学水平的提高，对抗生素应用的副作用有了深刻的认识。近年来，国内外不断出现的人畜共患病（禽流感、ＳＡＲＳ等）和禽畜产品安全性问题，引起了人们的高度关注甚至恐慌。因此，许多国家的管理部门加大了对有害饲料添加剂和药物使用的监控力度，严格和禁止使用抗生素等作饲料添加剂。使用饲用抗生素主要有以下几个方面的局限性ｕ””・：抗生素的滥用引起动物内源性感染或二重感染。抗生素的使用在抑制致病微生物的同时，也抑杀了动物内源性微生物，扰乱了微生物系统中种群或群落间相互制约的格局，破坏了微生态平衡，造成原籍菌或过路菌（主要指条件致病菌）过度繁殖而出现定位转移，从而引起二重感染或内源性感染。抗生素的使用引起耐药菌的产生，因而抗生素治疗疾病越来越不理想。而微３华南理工大学硕士学位论文生态制剂则从调整生态失调、恢复生态平衡入手，不存在抗药性这一弊端。长期使用抗生素可使畜禽细胞免疫、体液免疫功能下降，甚至导致动物发病或死亡。抗生素在畜产品中残留，对公共卫生产生不良影响，直接威胁着人类身体健康与安全。基于使用抗生素的弊端日益凸现，与抗生素和特异性预防制剂（如疫苗）等明显不同的，具有广谱的、非特异性抗菌、抑菌和杀菌作用的动物微生态制剂便应运而生。１．２动物微生态制剂概述１．２．１动物微生态制剂的定义动物微生态制剂是指在动物微生态学理论的指导下，调整微生态失调、保持微生态平衡、提高宿主健康水平或增进健康状态的益生菌及其代谢产物和生长促进物质制成的制剂（如寡糖类制剂）…，它包括益生素（ＰｒｏｂｉｏｔｉＣＳ）、益生元（ＰｒｅｂｉｏｔｉＣＳ）和合生元（ＳｙｎｂｉＯｔｉＣＳ）等。因此说动物微生态制剂也是兽医生物制品的一种。１．２．２动物微生态制剂所用菌株１９８９年美国食品与药物管理局（ＦＤＡ）与饲料协会（ＡＡＦＣＯ）发布了可以直接饲喂动物的安全菌株４３种，其中乳酸菌类１７株，双歧杆菌类６株，芽孢杆菌类５株，拟杆菌类４株，霉菌类２株（黑曲霉、米曲霉），酵母菌类２株，球菌和丙酸菌类７株。通常认为安全的直接饲用微生物种类见表１—２。我国农业部１９９９年公布了１２种可以直接饲喂动物的饲料级微生物菌种，包括干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母、沼泽红假单胞菌ｍ，。目前养殖生产中应用的动物微生态制剂多数是由以上单一或多种菌株加工而成的。１．２．２．１乳酸菌乳酸菌是动物微生态制剂中研究报道得最多的一类，是一种可以分解糖类产生乳酸的革兰氏阳性菌，厌氧或兼性厌氧生长。乳酸菌在ｐＨ值３．０～４．５时仍可生长，对胃中的酸性环境有一定的耐受性。在动物体内通过生物拮抗降低ｐＨ值，阻止和抑制致病菌的侵入和定植胃肠，特别是抑制大肠埃希氏菌、白痢沙门氏菌等病原菌的生长。同时通过竞争结合位点，抑制病原菌的生长ｍ・。乳酸菌亦可通过调节肠道ｐＨ值，以激活胃蛋白酶．促进胃肠蠕动，帮助食物的消化吸收．减轻涨气和促进肝脏功能。乳酸菌还能降解亚硝胺、氨、吲哚、粪臭素等有害物质，４第一章绪论维持肠道中正常的生态平衡，活菌体和其代谢产物中含有较高的超氧化物歧化酶（ＳＯＤ），能消除氧自由基的不利作用，增强体液免疫和细胞免疫Ｉｌ６１。乳酸菌可用于哺乳期和断乳期动物的饲料中。此外，乳酸菌能够通过增加小肠表面积来提高其消化功能…，…ｌ。乳酸菌的特点：是多种动物消化道主要的共生菌，能形成正常菌群：在微需氧或厌氧条件下产生乳酸：有较强耐酸性；产生一种细菌素（Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ），能有效抑制枯草杆菌、葡萄球菌的生长【１６ｌ。乳酸菌的缺点是耐热性差，６５℃～７５℃条件一Ｆ死亡．饲料颗粒化过程中瞬间高温即可将其杀死。目前主要应用的有嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和肠球菌。表ｔ－２可以直接用于生产微生态制剂的益生菌Ｔａｂｌｅ１－２Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｐｅｃｉｅｓｄｉｒｅｃｔｌｙｕｓｅｄｔｏｐｒｏｄｕｃｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍａｄｄｉｔｉｖｅｓ中英文名称黑曲霉Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ米曲霉Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ凝结芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ迟缓芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ地衣芽孢杆菌ＢａｃｉｌｌｕＳｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ短少芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ枯草杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ嗜淀粉拟杆菌Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ多毛拟杆菌Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ栖瘤胃拟杆菌Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｒｕｍｉｎｏｃｏｌａ产琥珀酸拟杆菌Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｕｉｓ青春双歧杆菌Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ动物双歧杆菌Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌ两歧双歧杆菌Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ婴儿双歧杆菌Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓ长双歧杆菌Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ嗜热性双歧杆菌Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ嗜酸乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ短乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ保加利亚乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ干酪乳杆菌Ｉ．ａｃｔｏｂａｅｉ¨ＵＳｃａｓｅｉ纤维二糖乳杆菌Ｉ．ａｃｔｏｂａｃｉｌｌＵＳｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ５华南理工大学硕士学位论文续上表中英文名称弯曲乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｕｒｖａｔｕｓ德氏乳杆菌ＬａｃｔｏｂａｃｉＩｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ发酵乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃ“Ｉｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ瑞士乳杆菌ＬａｃｔｏｂａｃｉｌＩｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ乳酸乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｌａｃｔｉｓ胚芽乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ罗特氏乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉｉ肠膜明串株菌Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ乳酸片球菌Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉｉ啤酒片球菌Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｄａｍｎｏｓｕｓ）戊糖片球菌Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｃｕｓ费氏丙酸杆菌Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ谢氏丙酸杆菌Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｈｅｒｍａｎｉｉ酿酒酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ乳酪链球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｒｅｍｏｒｉｓ二乙酰乳酸链球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ粪链球菌ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＦａｅｃａｌｉｓ中间链球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ乳酸链球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ嗜热链球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ酵母Ｙ色ａｓｔ１．２．２．２酵母西酵母细胞仅零星存在于动物肠道内。它是动物肠道内寄生的一类正常有益菌。酵母细胞富含蛋白质、核酸、维生素和多种酶，具有增加饲料适口性，促进动物对饲料的消化吸收能力等功能。并可提高动物对磷的利用率““。近期研究表明，某些酵母菌可以通过刺激瘤胃微生物的生长与活性，提高纤维索的利用率，这一过程发生在瘤胃消化纤维的早期阶段。酵母菌还可以促进乳酸的利用，这一过程通过以下三条途径实现：直接吸收利用乳酸：利用可以被其他微生物转变成乳酸的糖：刺激其他微生物利用乳酸。酵母菌还能对微生物蛋白合成产生影响，由于酵母菌具有选择性地刺激瘤胃某些微生物菌群的能力，因而６第一苹绪论影响到微生物合成蛋白质的质量（氨基酸的组成）ｍ一“。酵母制剂有利于预防畜禽胃肠道疾病，改善动物机体的健康状况。酵母细胞壁具有与毒素和病原菌结合的能力，刺激机体的免疫机能，提高机体抵御外来病原微生物侵害的能力。这一部分的研究有待进一步深入探讨。Ｉ．２．２．３芽孢杆菌芽孢杆菌是好氧菌，在肠道中主要通过生物夺氧维持肠道生态平衡，维持厌氧环境，增强肠道对厌氧菌的定植抗力。在肠道酸性环境中具有高度的稳定性，能分泌较强活性的胞外酶（如蛋白酶、淀粉酶和半纤维素水解酶），从而促进饲料营养物质的消化，提高饲料的利用率ｍｍ“。芽孢杆菌虽不是人和动物体内的正常菌群，但对人和动物不致病，将芽孢杆菌作为畜禽饲用的微生态制剂已有十几年的历史。目前使用的菌株主要有枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｂｔｉｌｉｓ）、地衣芽孢杆菌（ＢａｃｉＵＵＳｌｉｃｈｅｒｔｉｆｏｒｍｉｓ）、腊样芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｇ）和东洋芽孢杆菌（ＢａｃｉｌｌＵＳｔｏｙｏｉ）。１２．２．４光合细菌光台细菌是一种能够利用光能进行生长的水生微生物，其营养十分丰富，其不仅蛋白质含量高，氨基酸组成齐全，而且还富含各种维生素、辅酶Ｑ、抗病毒因子等多种生理活性物质。光合细菌作为饲料添加剂用于畜禽和水产业，除具有明显的增重效果，还具有一定的增色作用和增强机体抵抗能力的效果ｍＩ。目前研究较多的是红螺菌。１．３动物微生态制剂的防病促生长机制Ｉ．３。１对动物消化道微生态的调节１．３，１．１帮助建立和维持正常的肠道优势种群使用微生态制剂的目的在于通过补给优势菌株，与畜禽肠道内有益菌一起形成优势种群，维持正常微生态区系平衡。此外，在动物肠道非有益微生物区系建立前，给新生家畜、家禽饲喂益生菌有劝于畜禽建立正常的微生物区系，也能有效排除或控制潜在的病原菌“”。”。１。３．１。２通过生物夺氯方式阻止病原菌的繁殖微生态制剂中的需氧芽孢杆菌以孢子状态或其他活菌形式进入畜禽消化道后生长繁殖，消化肠道内氧气，使局部环境的氧分子浓度降低，造成厌氧环境，利用专性厌氧菌和兼性厌氧菌的定植和生长。使肠内微生物恢复平衡状态”“。７华南理＿［大学硕｝学位论文１．３．１．３通过黏附机制和竞争排斥作用阻止病原菌的繁殖某些益生菌通过与肠道中有害微生物的直接竞争和定居部位的竞争，可抑制病原菌微生物黏附或定植于肠道．或占据病原微生物的附着部位，形成保护屏障，防止其直接黏附到动物细胞上，且自身一般不会脱落，从而发挥其竞争性抑制病原体在禽畜肠道的黏附或定植的作用ｍ一。１．３．１．４通过产生代谢产物和生理活性物质杀害病原微生物一些微生物在其发酵过程中，会产生生理活性物质，直接调节微生物区系，抑制病原菌。如有些乳酸杆菌和链球菌可产生嗜酸菌素、乳酸菌素等；芽孢杆菌可产生多肽类的细菌素，对大肠埃希菌和白痢沙门氏菌有显著的抑制作用。这些抗菌性物质通过改变肠道内活菌的数量而发挥作用［２Ｓ－２Ｄ，。有些微生物代谢产生的有机酸能降低动物肠道ｐＨ值，杀死不耐酸的病原菌。芽孢杆菌还能产生过氧化氢，杀害许多潜在的病原微生物。…。１．３．２为动物机体提供营养、促进生长１３．２．１产生多种消化酶、提高饲料利用率芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，还能降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，释放出可被动物吸收的营养成分（２２Ｉ。保加利亚乳杆菌在肠道内可增强Ｂ一半乳糖苷酶的活性ｍ】。此外，益生菌还能诱导动物内源消化酶的分泌，提高饲料转化率［ＺｏＩ。１．３．２．２产生有机酸、促进营养物质吸收和激活酶原乳酸菌进入肠道内产生乳酸，降低肠道ｐＨ值，有利于铁、钙及维生素Ｄ等的吸收，激活蛋白酶，提高日粮养分的利用率，促进生长［１０１。一般而言，越小的家畜，消化酶对肠道ｐＨ值依赖性越强。１．３．２．３菌体本身为动物提供营养许多益生菌其菌体本身就含有大量营养物质，如光合细菌富含蛋白质，还有多种维生素、钙、磷和多种微量元素等，可直接被动物摄取利用“’。１．３．２．４合成维生紊研究表明，畜禽动物肠道的微生物群均可合成维生素Ｋ、Ｂ族维生素、Ｂ一胡萝ｈ素，并直接被动物吸收，从而加强动物的营养代谢ｍ，。１．３．３增强动物免疫系统功能８第一章绪论益生菌可产生菲特异性免疫调节因子，提高机体的抗体水平，产生干扰素，提高免疫球蛋白浓度和巨嗜细胞的活性，增强机体免疫功能和抗病力。试验证实了双歧杆菌细胞壁中的完整肽聚糖可使小鼠腹腔巨噬细胞ＩＬ－ｌ、ＩＬ一６等细胞因子的ｍＲＮＡ的表达增多，从而在调节机体免疫反应中起到作用ｍ，１３３１。乳杆菌能提高巨噬细胞的活性，并防止肿瘤的生长Ⅲｔｍｔ。潘康成用地衣芽孢杆菌饲喂家兔，家兔的免疫器官的生长速度明显加快，而且血液中的白细胞总数和外周血Ｔ淋巴细胞酸性醋酸萘酯酶活性（ＡＮＡＥ）阳性率均显著高于对照组Ｌ３６１。益生素的细胞壁上存在着肽聚糖，它通过激活黏膜免疫细胞而增加局部免疫抗体，增强抵抗有害微生物的能力［３７１。１．３．４其他机制１．３．４．１促进幼畜消化道发育和结构优化良好微生物菌群构成的微生态平衡对幼小动物消化道的正常结构与功能有积极的作用。研究发现，乳酸菌类益生菌有助于新生仔猪小肠绒毛的发育，促进断奶后仔猪肠绒毛的再生与恢复”…“…。１３。４．２防止有害物质的产生，改善环境动物微生态制剂的使用，可以加强肠内有益微生物的种群优势，抑制大肠杆菌的活动，扭转了大肠杆菌导致的蛋白质转化为氨和胺的倾向，具有除臭功能。微生态制剂还能防止动物肠道内有害菌产生的肠毒素、毒性胺、吲哚、甲烷等有毒物质的积累，有利于动物的健康“…“。１．４动物微生态制剂的应用及应用效果国内外动物微生态制剂的产品较多，在国外最有代表性的产品是日本学者比嘉照夫研制的ＥＭ微生物菌剂，由光合菌、酵母菌和乳酸菌等ｌＯ属８０多种微生物复合培养成的有效微生物群。在国内，报道较多的活菌制剂方面有以单一菌种组成的产品九九一畜禽宝和ＤＭ４２３菌粉，以混合菌组成的产品ＳＥＭ科隆粉、磊菌宝、保得微生肠道调理剂等。九九一畜禽宝采用地衣芽孢杆菌制成，对鸡急慢性肠炎、鸡白痢及各种原因引起的肠道菌群失调症的治疗疗效确切。ＤＭ４２３菌粉由需氧腊样芽孢杆菌制成，用于各种畜禽腹泻性疾病的预防和治疗，不产生抗药性，有明显的促生长和提高饲料转化率的作用。ＳＥＭ科隆粉富含３８种微生物，粗蛋白和氨基酸含量分别高达６２％和５３％以上．具有很高的酶活性。磊菌宝２则是一种能够高度降解粗纤维的活菌制剂。另外，市面上还有促康生、增菌素、抗痢宝、畜禽灵、光合细菌（ＰＳＲ）、复方回春生（双歧杆菌制剂）、益菌王等产品，名目繁多，差不多覆盖了整个养殖业。９华南理一ｒ大学硕士学位沧文动物微生态制剂在养禽业、养猪业、水产养殖以及反刍动物养殖业中都取得良好的效果。表现在以下几方面：１．４．Ｉ提高生产・『生能大量实验汪明，在鸡日粮中添加微生态制剂，能不同程度地提高肉鸡的生长速度及饲料转化率，蛋鸡的产蛋量，而且蛋黄的胆固醇含量明显下降，但对血液中酯类和胆固醇含量无影响【４２”“”。饲喂微生态制刺可以使仔猪成活率提高４％～５％，并显著提高仔猪日增重和饲料利用率”６１［４７１。用酵母培养物、乳酸杆菌制剂可通过增加反刍动物瘤胃中纤维素分解菌的数量，分泌酶刺激纤维素在胃中的消化，从而提高增重、产奶量并改善乳的组成｛４Ｓｌ。１．４．２防病治病用腊样芽孢杆菌、枯草杆菌、乳酸菌和光合细菌对猪细菌性痢疾的研究均表明有一定疗效。王士长等用微生态制剂防治肉鸡大肠杆菌病和沙！‘］氏菌病的试验表明，添加微生态制剂组腹泻率和死亡率分别降低７０．８％和６８．１％【４９１。Ｐａｒｄｕｅ等试验发现，不论是把微生态制剂添加到雌鸡的Ｆ１粮中还是饮水中，均可使试验组的鸡白痢发病率下降３０％，而生长速度提高ｌＯ％。１．４．３替代抗生素邢军等用９６０只１２日龄罗曼蛋雌鸡进行为期３３天的试验，比较了不同单一菌株、复合菌群以及抗生素药物的使用效果，结果表明，不论是曰增重、饲料转化率还是成本都比对照组有了明显的改善（４３Ｉ。Ｇｒｅｌａ比较了某微生态制剂（Ｖｅｌａｂ）和阿伏霉素对仔猪的促生长作用，结果Ｖｅｌａｂ处理组哺乳期仔猪体重比阿伏霉索处理组和对照组分别增重２％和８．３％【５０Ｉ。１．５影响动物微生态制剂的使用效果的因素１．５．１水分的影响一般来说，活菌制剂随着水分的升高，时间延长，微生物的存活率降低。不同细菌对水的耐受力明显不同，孢子型细菌耐受性最好，肠球菌、粪链球菌次之，乳杆菌再次之。酵母菌对水的耐受性较好。目前市场上很多微生态制剂已使用脱水剂，以延长保存时间。１．５．２外界因素的影响大部分活菌制剂都采用低温干燥工艺，因此保存要求环境温度较低，当储存温度超过３０４Ｃ时，制剂活性就会受到影喻，尤其是非孢子态微生物。第一苹绪论１．５．３氧化和抑菌物质大部分动物微生态制剂中的微生物菌株属于厌氧或兼性厌氧型，对氧气耐受性较差。某些抗生素、磺胺类药物以及不饱和脂肪酸、矿物质预混剂、浓缩料等都会使活菌活性降低。１．５．４保存时闻随着时间推移，活菌数不断减少，减少速度因微生物种类不同而异。以芽孢杆菌最为稳定，其次是肠球菌群中的粪肠球菌，再次是乳杆菌，稳定性最差的是双歧杆菌。１．５．５饲用方式与剂量同一使用剂量，饮水效果较好。１．５．６动物种类动物种类不同，要求益生菌组合也不同。适用于单胃动物的微生态制剂所用菌株一般为乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等，而适于反刍动物的却是真菌、酵母菌等。１．５．７动物生理状态在研究仔猪生产性能时发现，仔猪处于外界环境变化等应激时期，益生菌能发生最佳作用，而当仔猪肠道微生物区系状况良好时．益生菌的作用很小ｍＩ。１．５．８饲料类型及成分饲料成分的理化性质与微生态平衡也有一定的关系，例如饲料粒度、淀粉糊化程度、饲料中微生物群结构等都不同程度地影响着动物胃肠道的微生态平衡。１．５．９饲料加工过程在制粒与膨化过程中，高温、高压、蒸气明显影响益生菌的活性。不同的菌种的高温耐受力差异较大，芽胞杆菌耐受力最强，ｌｏｏ℃下２ｍｉｎ损失只５％～１０％，而在８０℃下５ｍｉｒｌ，乳酸杆菌、酵母菌损失７０％～８０％，９５℃下２ｍｉｎ损失９８％～９９％。一般制粒８０℃～１００℃对芽胞杆菌影响较小，有１０％～３０％孢子损失，对乳酸杆菌、酵母菌和粪链球菌等影响较大。１．６组成微生态制剂的益生菌必须具备的条件组成微生态制剂的益生菌必须具备以下条件：①不能产生任何内外毒素，即毕甬理工大学畈士掌位论文无毒、无害、安全、无副作用：②有利于促进体内菌群平衡：③为了具有较好的黏附性能ｔ最好采用来源于动物的益生菌；④对于必须以活菌体形式才能发挥作用的益生菌，如双歧杆菌、乳杆菌类，还需要耐酸、耐胆盐。另外，为了实际生产需要，益生菌株应有生长速度快、存活期长、易保存等特性。１．７动物微生态制剂存在的问题ｔ．７．１安全性问题微生态制剂的安全性必须考虑以下几个方面：①应用于动物的益生菌最好来源于同种动物：②益生菌必须从健康的动物中分离：③益生菌必须经过一定的时间来证明其无致病性：④益生菌不能有与疾病相联系的历史；⑤益生菌不能携带町以转移的抗生素抗性基因㈣［５２１。耐药性微生物携带的某种抗生素抗性基因可能随着质粒的迁移而在不同种属之间进行传递”１Ｉ。就目前而言，市场上的动物微生态制剂基本上都是野生菌株或是经驯化培育而成的菌株，有些没有用分子生物学的方法进行这些方面的检测。乳杆菌天生对许多抗生素具有抗性，但在大多情况下，这种抗性不能转移。这些具有非转移抗生素抗性基因的乳杆菌，一般不必考虑其安全性。干酪巍杆菌和鼠李糖乳杆菌对万古霉素天生具有抗性，它们作为安全的益生菌使用了多年，没有发现其抗性基因转移给其他细菌ｍＩ。在乳杆菌中，只有极少数菌株的抗抗生素基因是由质粒编码的，使用这些乳杆菌时就要考虑其安全性。当正常的微生物区系被打破后，也还必须考虑由此而可能导致的扰乱『Ｆ常动物微生物区系、特定环境下产生有害代谢产物以及潜在地致病性问题。１．７．２产品活性的保存问题如何保证使用产品时有足够活力和数量的微生物活菌，并能在到达动物体内后能够保持较强的活性是目前急需解决的问题。在产品活性的保存方面，目前常采用真空冷冻技术、双层包埋，微胶囊等技术，也有用真空包装或是充氮气包装等形式。微生态制剂的微胶囊技术是解决产品保存问题的重要技术，这一技术利用合适的囊材把菌体包裹住，使之与外部隔绝，以达到保护的目的。微囊中除含有大量活菌外，还具有良好的耐胃酸和肠溶性能，在常温下的货价期可达一年以上。日本森下仁丹公司最早采用疏水微胶囊技术研制的ＢｉｆｉｎａｌＯ号，一次性可把十亿个活菌安全通过胃送入肠道。华南理工大学食品与生物工程学院采用微胶囊技术制备活性双歧联株耐酸肠溶微囊制剂，也可将十亿个以上活菌安全送进肠道““。美国Ａ１１ｔｅｃｈ生物中心研制出益生素囊，试验证明，这种用Ｂ一葡聚糖微囊化的产品在室温下保存３６个月对活力无影响。第一章绪论另外基因工程技术已广泛应用于益生菌的选育，如运用基因工程技术构建更利于生产、保存、定植、繁殖或具有特殊功能的工程菌制剂。１．７．３功效评价的问题目前微生态制剂的检测与质量评价尚无统一的方法和标准，亦无统一的检测部门。国内外关于动物微生态制剂的使用效果的实验报道很多，其有益作用已被确认，但也有效果不理想的报道。这些报道不一致的地方体现在：①结果的不稳定性。某处作出的正面结果，其他人不能重复证实；②同一个产品在不同场所使用的效果不同：③在畜禽处在不同生长阶段、不同健康状况或者不同的饲养环境时，产品表现的效果不同［５６１。因此，功效评价时：①需在特定的饲养环境条件下进行，因为每种产品有对应的功效以及各自最适宜的使用对象：②由于饲养环境和畜禽健康状态的易变性，评价微生态制剂时，须做纵向（同一个场地多批次试验）和横向（多个场地同时试验）的多次比较，得出的结果才可靠合理。１．８遗传修饰的微生态制剂国内外对微生态制剂的研究虽然进展迅速，但目前市场上基本还是天然野生菌的产品，治疗范围主要是消化道。随着对益生菌的遗传修饰，微生态制剂的应用范围会拓宽，效果会更好。正在对动物微生态制剂组成的益生菌进行遗传修饰的有以下几方面：①对抗寄生虫基因的克隆，以防治寄生虫疾病的发生；②对致病菌抗原基因的克隆，以防治传染病：③对饲料酶基因的克隆，以促进消化，增加营养。１．９本研究课题的来源及主要内容本研究是省农业攻关项目“安全高效无残留的新型畜禽用微生态制剂的研制与应用”的一部分，文件编号为粤科技字［２００２］１４１号。本研究创新之处在于：全部有益菌均分离自健康鸡的肠道，属于生理性细菌。由于不同来源菌种的特性和功能各异，对宿主动物肠道的粘附作用也有种属特异性。目前国内市场的动物微生态制剂所使用的益生菌菌株，大多是从人和哺乳动物的体内，或是从土壤中分离获得，而从家禽体内直接分离出益生菌的研究还比较少。本研究为研制禽类用动物微生态制剂提供了合适的菌种。从健康小鸡肠道中分离出鸡双歧杆菌，在国内尚未见有报道。根据单胃动物的特点，采用多菌种制剂。其目的在于不同菌株之间功效可以互补，增强制剂的有效性，扩大条件范围和应用范围。这是微生态制剂发展方向１３华南理工大学硕七学位论文之一。本研究主要内容包括：从健康鸡的肠道中分离筛选出双歧杆菌、乳酸杆菌、屎肠球菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌（均为美国食品与药物管理局和美国饲料公定海会公布的对动物无致病性、可直接用于动物饲料的菌株），并进行了初步鉴定。探讨了其发酵特性和拮抗病原菌、拮抗抗生素的特性。同时考虑了筛选出的菌株间的拮抗性及相容性。本研究为研制动物微生态制剂提供了合适的菌种，而益生菌与常用抗生素的配伍禁忌，为生产实践提供一定的理论依据。同时为鸡的肠道微生态环境研究提供了资料。本项目所研制的目标产品，为一种新型高效的益生菌制剂产品，其技术含量较高。采用微型包囊技术，研制出由耐酸肠溶微囊组成的新一代禽畜用益生菌制剂，国内尚未见有报道或研究成果。该项目完成后，将填补我国禽畜用高效微囊化益生菌制剂生产的空白，可达到国内领先的技术水平。１４第二章材料与方法第二章材料与方法２．１实验材料与仪器设备２．１．１材料２．１．１１样品来源本实验分离样品来源于华农实验鸡场的健康实验用鸡以及五山肉菜市场购买健康成年鸡。２．１．１．２指示菌株鸡大肠埃希氏菌０—７８（Ｅｓｃｈｗｅｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）ｐｕｌｌｏｒｕｍ）金黄色葡萄球菌Ｃ５８０００（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｏｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以上菌株均由华南农业大学动物科学系赠送。２１．１．３主要实验试剂ｒａｐｉｄＩＤ３２鉴定试剂条法国生物梅里埃公司厌氧发生剂法国生物梅里埃公司ＪＡＭＥＳ、ＮＩＴｌ、ＮＩＴ２、ＦＢ试剂法国生物梅里埃公司硫酸新霉素美国Ｓｉｇｍａ公司巴龙霉素美国Ｓｉｇｍａ公司低聚果糖日本葡萄糖汕头市化学试剂厂大豆蛋白胨广东环凯微生物科技公司进口分装蛋白胨广东汕头市生化制药厂胰蛋白胨广东环凯微生物科技公司进口分装牛肉膏广东环凯微生物科技公司胰酶水解酪蛋白广东环凯微生物科技公司Ｌ一半胱氨酸上海伯奥生物科技有限公司乳糖广州化学制剂厂可溶性淀粉广州台山化工厂玉米淀粉广州台山化工厂吐温一８０广州化玻公司进口分装酵母浸出膏广州江门市红星酵母厂琼脂湛江霞山台光食品厂１０２型定性滤纸浙江杭州新华纸业公司鸡白痢沙门氏菌Ｏ一７９（Ｓａｉｍｏｎｅｌｌａ——生化鉴定管兰要坚兰：盔兰堕：！兰堡堡苎广州环凯微生物科技公司丙酮酸钠苷氨酸氯化锂广州化学制剂厂广州化学制剂厂广州化学制剂厂２．１．２主要仪器与设备厌氧发生袋超净工作台Ｓｗ—ＣＪ一２ＦＤ法国生物梅里埃公司苏州苏净集团安泰技术有限公司生化培养箱可见光分光光度计ＳＰＸ一２５０Ｂ—Ｚ型２２ＰＣ上海实业有限公司上海棱光技术有限公司江阴滨江医疗设备厂手提式压力蒸汽消毒器Ｙｘ一２８０微量移液器微量移液器电子天平２００～１０００ｕＬ上海求精生化试剂仪器公司上海求精生化试剂仪器公司上海第二天平仪器厂５～５０ｕＬＭＰ２００Ｂ旋涡混合器ｘｗ一８０Ａ上海医疗大学仪器厂上海安亭科学仪器厂离心机８００Ｂ电热恒温水浴锅Ｈ・Ｓ・Ｇ—ＩＩＢ一４上海讯大机电仪器仪表有限公司上海精密科学仪器有限公司日本ＳＡＮＹＯ精密ｐＨ计ＰＨＳ一３Ｃ超低温冰箱ＭＤＦ一２９３冷冻真空干燥机ＡＬＰＨＡ卜４德国ＣＨＲＩＳＴ。ｈ海浦东物理光学仪器厂日本ＯＬＹＭＰＵＳ光学显微镜ＸＳＰ一２荧光生物显微镜高效液相色谱仪ＢＸ５１６００—９６６美国Ｗａｔｅｒｓ公司２．２实验方法２．２．１鸡源双歧杆菌的分离、纯化２．２．１．１培养基的选择１．缓冲蛋白胨水溶液（苏世彦，１９９８）蛋白胨ｌＯｇ，Ｎａ：ＨＰＯ。２９，葡萄糖５９，Ｋ：ＨＰＯ；２９，ＫＣＩ５９，蒸馏水１０００ｍＬ。取ｌＯｍＬ缓冲蛋白胨水置于５０ｍＬ三角瓶．加入少量玻璃珠，１２ｌ℃［５ｍｉｎ灭菌后备用。２．ＴＰＹ培养基胰蛋白酶ｌＯｇ，大豆蛋白胨５９，酵母膏２．５９，葡萄糖５９，半胱氨酸盐酸盐０．５９，吐温８０ｌｍＬ，Ｋ２ＨＰＯ。２９，ＭｇＣｌ２・６Ｈ２００．５９，ＺｎＳ０４・６Ｈｚ００．２５９，Ｃａｃｌ２０．１５９，Ｆｅｃｌ。微量，ＣａＣＯ。５９，琼脂２０９，蒸馏水［０００ｍＬ。１６第二章材料与方法凋ＰＨ８．５，１２ｌ℃１５ｍｉｎ灭菌。３．液体增殖培养基（杨汝德老师提供）葡萄糖２０９，胰蛋白胨５９，大豆蛋白胨５９，牛肉膏ｌＯｇ，酵母提取物ｌＯｇ，牛肝液ｊＯｍＬ，低聚果糖５９，Ｎａｃｌ３９，ＢＨＰＯ。２９，卜半胱氨酸ｌｇ，蒸馏水１０００ｍＬ。凋ＤＨ７．０，１２ｌ℃１５ｍｉｎ灭菌。４．ＢＳ培养基西红柿汁２００ｍＬ，蛋白胨７９，酵母粉６９，胰酶水解酪蛋白５９，植物蛋白胨３９，多胨３９，葡萄糖ｌＯｇ，可溶性淀粉０．５９，吐温８０ｌｇ，溶液ＡＩＯｍＬ，溶液Ｂ５ｍＬ，琼脂２０９，Ｌ－半胱氨酸盐酸盐０．５９，ＢＳ添加液５０ｍＬ，肝浸液１５０ｍＬ，蒸馏水８００ｍＬ（１）除Ｂｓ添加液外，其他成分加热溶解，凋ｐＨ至７．２，１１５．６℃高压灭菌２０ｍｉｎ冷至５０℃时加Ｂｓ添加液，混匀倾注平皿。（２）Ｂｓ添加液：丙酸钠３０９加入灭菌烧瓶中．加灭菌蒸馏水８０ｍＬ，待溶解后加硫酸新霉素４００ｍｇ，巴龙霉素ｌＯＯｍｇ，ＬｉＣｌ６９，再加灭菌蒸馏水至ｌＯＯｍＬ，４℃保存。（３）溶液Ａ：Ｋ：ＨＰＯ。２５９，ＫＨｚＰＯ。２５９，水２５０９。（４）溶液Ｂ：ＭｇＳＯ。・７Ｈ：０ｌＯｇ，ＦｅＳ０４・７Ｈ。００．５９，ＮａＣｌ０．５９，ＭｎＳＯ。０．３３７９，水２５０９。２．２．１．２分离方法１５天龄健康小鸡剖杀后，取盲肠内容物１９置于装ｌＯｍＬ缓冲蛋白胨水的三角瓶中，震荡均匀。ｌＯ倍梯度稀释至ｌＯ～，取１０～～ｌＯ。７各０。ｌｍＬ涂布Ｂｓ琼脂平板，放于厌氧发生袋中，３８。Ｃ厌氧培养４８～７２ｈ。挑选光滑、凸圆、边缘整齐、白色或乳白色、质地柔软的特征菌落，进行革兰氏染色，挑选革兰氏阳性和具有双歧杆菌形态特征的菌落。再进行需氧和厌氧培养，选取只在厌氧培养生长的菌落。进一步在ＴＰＹ琼脂平板上纯化菌株，直至镜检为纯菌株。２２．１．３厌氧方法采用厌氧发生袋法２．２．２鸡源双歧杆菌的筛选２．２．２．１生长活性与产酸能力比较１．菌液吸光度（ＯＤ。）的测定用分光光度计在６００ａｍ下测定待筛菌培养２４ｈ的菌液的吸光值。２．菌液ｐＨ的测定在室温下测定待筛菌培养２４ｈ的菌液的ｐＨ值。１７华南理工大学硕士学位论文３．生长曲线的绘制待筛选菌株分别以５％接种于装有２００ｍＬＴＰＹ培养基的三角瓶中，３８。Ｃ厌氧培养，每４ｈ取样测定吸光值及培养基中的ｐＨ值的变化．共计４８ｈ。以培养时间为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制生长曲线。２．２．３鸡源双歧杆菌的特性研究２．２３．１最适初始ｐＨ值在基本培养条件下，将灭菌后培养基的初始ｐＨ值由７．０分别调为５．０，５．５６．０，６．５，７．０，７．５。然后５％接种培养２４ｈ，测定发酵液的ＯＤ值。２２．３．２最适培养温度在基本培养条件下，将培养温度由３８。Ｃ改为分别在３２℃，３７℃，４０。Ｃ下培养２４ｈ，测定发酵液的ｏＤ值。２．２．３．３培养基优化１．菌种的活化、传代与接种选用ＴＰＹ培养基活化冻干的菌种，４０℃厌氧培养４８ｈ，传代按５％接种量进行。２氯源的优化固定矿物质、Ｌ一半胱氨酸盐酸盐、碳源、双歧因子的用量，采用正交实验设汁（Ｌ。（３‘））来优化氮源的用量，因素水平见表２一ｌ，其中因素Ａ为酵母浸出物，Ｂ为胰蛋白胨，Ｃ为大豆蛋白胨，Ｄ为牛肉膏。表２一ｌ培养基中氮源优化正交实验因素水平表Ｌ。（３４））Ｔａｂ．２—１ＯｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｉｎｏｐｔｉｍｉＺｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｒｓＯｎｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｉｒｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉＵｌＩｌ３．鸡源双歧杆菌培养基的优化根据优化出来的显著因素来确定它们的水平，酵母膏的量固定为０．９％，采用正交实验设计Ｌ。（３４）优化双歧杆菌培养基。因素水平见表２—２，其中因素Ａ为氮源（酵母膏：胰蛋白酶：大豆蛋白胨），Ｂ为碳源，Ｃ为双歧因子，Ｄ为生长因子。第二章材料与方法表２—２鸡源双歧杆菌培养基的优化正交实验因素水平表Ｔａｂ．２－２ＯｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｉｎｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｒｓＢ．ｐｕｌｌｏｒｕｍｏｎｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ水平因素Ａ（％）Ｂ（％）Ｃ（％）Ｄ（％）２２．３４生长曲线测定１．菌液吸光度（ＯＤ。。。）的测定用分光光度计在６００ｒｉｍ下测定菌液的吸光值。２．菌液ｐＨ的测定用ｐＨ计在室温下测定ｐＨ值。３．生长曲线和ｐＨ值变化曲线的绘制菌种活化扩培后，以５％的接种量接种装有２００ｍＬ优化培养基的三角瓶和２００ｍＬＴＰＹ培养基的三角瓶，４０℃厌氧培养，分别于４ｈ，８ｈ，１２ｈ，１４ｈ，１６ｈ，１８ｈ，２０ｈ，２４ｈ取样测定吸光值，同时测定培养基中的ｐＨ值的变化。以培养时间为横坐标，分别以相应的吸光值和ｐＨ值为纵坐标，绘制生长曲线和ｐＨ值变化曲线。４平板菌落计数样液采用ｌＯ倍梯度稀释，选取适当稀释度倾注平板，４０℃厌氧培养４８小时后计数。２．２．４鸡源双歧杆菌的初步鉴定２．２．４。１形态学鉴定取典型菌落涂片，革兰氏染色，观察菌体形态。２．２．４．２生理生化特性鉴定纯化菌株经革兰氏染色、镜检观察形态后，确定待测菌株。将待测菌株的单个菌落分别接种至ＴＰＹ平扳上用于系列生化鉴定，４０＂Ｃ厌氧培养４８ｈ。具体方法参照文献［５７］中提供的生理生化鉴定方法。２．２．４．３高效液相色谱分析色谱条件：选用Ｃ１８反向柱：柱温：室温：柱压：１５００ＰＳＩ；流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ。１９华南理工大学硕十学位论文流动相：０，０１ＭＨ：ＳＯ，，ｐＨ２．５。缓冲液：０．００５ＭＨ：ＳＯ，，超声波脱气。乳酸标样：０．５ｍｌ乳酸＋ｌＯｍｌ缓冲液乳酸＋醋酸标样：０．５ｍＬ乳酸＋ｌｍＬ醋酸＋ｌＯｍＬ缓冲液样品的预处理：取样品２４ｈ发酵液，经８０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ后，取上清液，０．２２微米滤膜超滤后备用。２．２．５鸡源乳酸杆菌的分离纯化２．２．５１培养基的选择１．缓冲蛋白胨水溶液（苏世彦，１９９８）蛋白胨ｌＯｇ，Ｎａ。ＨＰＯ。２９，葡萄糖５９，ＫｚＨＰＯ。２９，ＫＣｌ５９，蒸馏水１０００ｍＬ。取ｌＯｍＬ缓冲蛋白胨水置于５０ｍＬ三角瓶，加入少量玻璃珠，１２１℃１５ｍｉｎ灭菌后备用。２．酸化ＭＲＳ培养基蛋白胨ｌＯｇ，牛肉膏ｌＯｇ，酵母提取物５９，Ｋ。ＨＰＯ；２９，柠檬酸二铵２９，乙酸钠５９，葡萄糖２０９，吐温８０蒸馏水１０００ｍＬ。调ｐＨ５．５－６．０，１２１℃１５ｍｉｎ灭菌。ｌｍＬ，ＭｇＳＯ；・７Ｉｔ：００．５８９，ＭｎＳＯ。・４Ｉｆ：００．２５９，３．选择性ＳＬ培养基酪朊水解物ｌＯｇ，ＭｎＳＯ。・４Ｈ：００．ｔ５９，酵母提取物５９，Ｋ３ＨＰＯ。６９，葡萄糖２０９，ＦｅＳＯ，・７Ｈ。００．０３９，枸橼酸二铵２９，吐温８０ｌｍＬ，乙酸钠２５９，ＭｇＳＯ。・７Ｈ：００．５８９，琼脂１５９，蒸馏水１０００ｍＬ。将琼脂溶解在５００ｍＬ沸水中，其他组分溶解在５００ｍＬ水中，用冰醋酸调ｐＨ至５．４，与融化的琼脂混合后再煮沸５ｍｉｎ，倾入培养皿，或趁热分装入已灭菌的试管中，无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。４．牛乳培养基１０％的脱脂奶２．２．５．２分离方法１０天龄健康小鸡剖杀后，取小肠内容物ｌｇ置于装ｌＯｍＬ缓冲蛋白胨水的三角瓶中，震荡均匀。１０倍梯度稀释，选３个适宜稀释度各０．１ｍＬ涂布ＳＬ平板，放于厌氧发生袋中，３８℃厌氧培养４８～７２ｈ。挑选直径约０．５～２ｍｍ，白色、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、凸起的特征菌落，传于酸化ＭＲＳ琼脂培养基纯化菌株。淘汰球菌及葡萄糖发酵产气的菌株。进行革兰氏染色，挑选革兰氏阳性，镜检为杆状，多排列成长短不一的链状，也有单个分散排列的特征菌落的作为待测菌株。２０第二章材料与方法２．２．５．３厌氧方法采用厌氧发生袋方法２。２。６鸡源乳酸杆菌的筛选２．２．６．１待筛选菌株凝乳速度比较将待筛选菌株接种牛乳培养基，３８＂Ｃ厌氧培养，比较凝乳时间。２．２．６．２待筛选菌株抑菌活－｝生比较将待筛选菌株接种ＭＲＳ培养基，３８℃厌氧培养４８ｈ．４０００ｒ・ｍｉｎ。离心ｌＯｍｉｎ。将活化好的适量浓度的指示菌（每个平板含菌２０００～３０００个）接种于营养琼脂平板上，固定菌落ｌｈ，放入牛津圈，在其内滴入被筛选菌株发酵培养物的上清液，３８℃培养２４～２８ｈ，测量抑菌圈大小。２．２．７鸡源乳酸杆菌的特・陡研究２２．７．１生长曲线测定培养基采用２．２．３．１优化的培养基，方法同２．２．３．４２．２．８鸡源乳酸杆菌的初步鉴定２．２．８．１形态学鉴定取典型菌落涂片，革兰氏染色，观察菌体形态。２．２．８．２生理生化特性鉴定纯化菌株经革兰氏染色、镜检观察形态后，确定待测菌株。进行接触酶试验、氧化酶试验、盐还原反应、联苯胺反应、吲哚及硫化氢产生试验，酪素分解及明胶液化试验以及糖发酵实验””。观察该菌在１５＂Ｃ是否生长，ｐＨ４．５是否生长。２．２．８．３ＲａｐＩｄｌＤ３２试剂条鉴定待测菌株纯化后，在ＭＲＳ平板上培养１８ｈ，用无菌棉签收集菌体在装有２ｍＬ无菌蒸馏水的安培瓶中，制成Ｍｃｆａｒｌａｎｄ４单位的菌悬液。接种试剂条，有氧条件下３７＂Ｃ４ｈ。读取结果，用ＡＰＩＬＡＢ软件获得鉴定结果。２．２．８．４高效液相色谱分析方法同２．２．４．３２．２，９鸡源屎肠球菌的分离纯化２ｌ华南理工夫学硕十学位论文２．２．９．１培养基的选择ｉ．缓冲蛋白胨水溶液（苏世彦，１９９８）蛋白胨ｌＯｇ，Ｎａ：ＨＰＯｔ２９，葡萄糖５９，Ｋ２ＨＰＯ；２９，氯化钾５９，蒸馏水１０００ｍＬ取ｌＯｍＬ缓冲蛋白胨水置于５０ｍＬ三角瓶，加入少量玻璃珠，１２１℃１５ｍｉｎ灭菌后备用。２．肠球菌选择性培养基（Ｅｃ）胰蛋白胨２０９，酵母膏５９，葡萄糖２９，Ｎａ：ＨＰＯ，４１５ｇ，ＫｚＨＰＯ。４ｇ，琼脂ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ调ｐＨ７．４，冷至４５～５０℃加入ＮａＮ。０．４ｍｇ／ｍＬ，氯化三苯四唑（ＴＴＣ）０．１ｍｇ／ｍＬ，倒平板。３．ｗＨ培养基（杨汝德老师提供）蛋白胨２０ｇ，酵母膏５ｇ，葡萄糖５ｇ，ＮａＣｌ５ＮａＮ。０．４ｇ，Ｎａ：ＨＰＯ；ｌｇｇ．琼脂１５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ调ｐＨ７．６，１２ｌ℃１５ｍｉｎ灭菌２２９２分离方法１．取３０天龄健康小鸡剖杀后，取直肠内容物Ｌｇ置于装１０ｍＬ缓冲蛋白胨水的三角瓶中，震荡均匀。１０倍梯度稀释，选３个适宜稀释度各０．１ｍＬ涂布Ｅｃ琼脂平板．３８℃培养４８ｈ。挑选紫红色，表面光滑凸起、边缘整齐，直径约１．０～１．５ｍｍ的特征菌落。传于ｗＨ斜面培养后进行革兰氏染色，镜检挑选革兰氏阳性，圆形或卵圆形，单个、成对或短链状排列的菌株纯化培养。２．将纯化菌株进行生长特性实验，接种６．５％氯化钠肉汤培养基和七叶苷斜面，３８℃、４８ｈ培养后，选择七叶苷水解阳性、６．５％氯化钠肉汤培养基上生长的菌株作为待筛菌株”’…。２．２．１０鸡源屎肠球菌的筛选将待测菌株接种ＥＣ基础液体培养基，３８℃、４８ｈ培养，传到平板上，挑起单个菌落，分别传于ＥＣ基础半固体培养基和ＥＣ固体斜面上，培养３８℃、４８ｈ。选择经上述过程生长良好的菌株。２．２．１１鸡源屎肠球菌的特性研究２．２．１１．１生长曲线测定培养基采用２．２．３．１优化的培养基，方法同２．２．３．４２．２．１２鸡源屎肠球菌的初步鉴定第二章材料与方法２．２１２．１形态学鉴定将斜面或半固体深层保存菌种划线接种于ｗＨ平板，３８℃、２４ｈ需氧培养，挑取典型菌落涂片，革兰氏染色，观察菌体形态。２．２生理生化特性鉴定２．２．１纯化菌株经革兰氏染色、镜检观察形态后，确定待测菌株。进行生化鉴定实验，具体操作参考文献“７’５“。观察该菌在６０℃、３０ｍｉｎ加热后是否生长。２．２１２．３高效液相色谱分析方法同２．２．４．３２．２．１２２．１３鸡源地衣芽孢杆菌的分离纯化３．１培养基的选择１．斜面培养基（郝土海，１９９２）牛肉膏３９，蛋白胨ｌＯｇ，ＮａＣｌ５９，琼脂２０９．蒸馏水１０００ｍＬ调ｐＨ７．０，１２１℃３０ｍｉｎ灭菌２．ＢＬＩ培养基可溶性淀粉３９．牛肉膏５９，蛋白胨ｌｏｇ，ＮａＣｌ５９，琼脂２０９调ｐＨ７．０～７．２，１２ｌ℃３０ｍｉｎ灭菌２２．１３．２分离方法Ｌ取３０天龄健康小鸡剖杀后，取直肠内容物１９置于装ｌＯｍＬ缓冲蛋胨水的三角瓶中，震荡均匀。１０倍梯度稀释，选３个适宜稀释度各０．１ｍＬ涂布ＢＬＩ琼脂平板．３５℃培养４８～７２ｈ。挑选圆形，乳白色，边缘整体、凸起，表面不很光滑，湿润，不透明菌株。进行革兰氏染色，挑选革兰氏阳性，镜检菌体大小为２．２～２．５ｕｍ×０．６５～Ｏ．７５ｕｍ，芽孢中生，椭圆形菌株ＢＬＩ液体培养基中纯化培养。２．将纯化菌株进行生长特性实验，分别于１５℃、５５℃，７％ＮａＣｌ条件下培养，以上条件均生长的菌株作为待测菌株。２．２．１４鸡源地衣芽孢杆菌的筛选将活化好的适量浓度的指示菌大肠埃希氏菌０．７８，调每个平板含菌２０００３０００个，接种于营养琼脂平板上，固定菌落ｌｈ，放入牛津圈，在其内滴入被筛选的菌株７２ｈ培养液的上清液，３５℃培养２４～４８ｈ，比较抑菌圈大小，选择抑菌活性强的菌株。——．２．２．１２．２．１兰壹堡三盔兰堡主兰竺笙兰５鸡源地衣芽孢杆菌的特性研究在基本培养基组成不变的前提下，将灭菌后培养基的初始ｐＨ值由７．０分５．１最适初始ｐＨ值别调为６．０，６．５，７．０，７．５，８．０，然后５％接种培养２４ｈ。采用活菌计数法测定发酵液中的活菌含量。２．２．１５．２最适培养温度在基本培养条件下，将培养温度由３０。Ｃ改为分别在２０，２５，３０，３５．４０４５℃，５％接种培养２４ｈ。采用活菌计数法测定发酵液中的活菌含量。５．３培养基优化２．２．１１．碳源的优化基础培养基其他组分不变，将碳源分别定为蔗糖３％，葡萄糖３％，乳糖３％，可溶性淀粉３％，玉米淀粉３％。制成培养基后按５％接种培养２４ｈ，用活菌计数法测量发酵液中的活菌含量。２．氮源的优化基础培养基其他组分不变，将氮源分别定为蛋白胨０．５％＋酵母膏１．Ｏ％．酵母膏１．５％，蛋白胨１．５％，牛肉膏１．５％．ＮＨ４Ｃ１０．５％，尿素０．５％，ＮａＮ０１０．５％。制成培养基后按５％接种培养２４ｈ，用活菌计数法测量发酵液中的活菌含量。３．无机盐的优化基础培养基其他组分不变，将无机盐分别定为ＣａＣｌ２０．４％，ＫＣｌ０．４％，ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．４％，Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）・２Ｈ２０Ｏ．４％，ＮａＨ２Ｐ０４＋Ｎａ２ＨＰ０４０．２％＋０．２％，制成培养基后按５％接种培养２４ｈ，用活菌计数法测量发酵液中的活菌含量。４．生长因子的添加量在基础培养基的基础上，添加富含生长因子的玉米浆分别为０％，０．５％，ｌ，０％，１．５％，２．Ｏ％，２．５％．３％。按５％接种培养２４ｈ，用活菌计数法测量发酵液中的活菌含量。５．鸡源地衣芽孢杆菌培养基的优化培养基的各组分之间有一定的内在关系。采用正交实验的方法研究碳源、氮源、无机赫和生长因子等单因子对菌株的影响，确定它们的水平。采用正交实验设计Ｌ。（３４）优化培养基，每组做两个平行。因素水平见表２—３，其中因素Ａ为氮源，Ｂ为碳源，Ｃ为无机盐，Ｄ为生长因子。２４第二章材料与方法表２—３鸡源地衣芽孢杆菌培养基的优化正交实验因素水平表Ｔａｂ．２－２ＯｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｉｎｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｒｓＢａｃｉｌｌｕｓ］ｉｃｈｅｎｉ［ｏｒｍｉｓｏｎｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ２２１５．４生长曲线测定菌种活化扩培后，以５％的接种量接种于２００ｍＬ优化培养基的三角瓶中，３０℃培养，发酵过程中每３ｈ取样测定活菌数，直至３０ｈ时止。以相应的活菌数为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制生长益线。２．２．１２２．１６鸡源地衣芽孢杆菌的初步鉴定６．１形态鉴定将菌种划线接种于ＢＬＩ平板，３７。Ｃ、２４ｈ需氧培养，挑取典型菌落涂片．革兰氏染色，观察菌体形态。２２１６．２生理生化鉴定纯化菌株经革兰氏染色、镜检观察形态后，确定待测菌株。进行生长特性实验和生化鉴定实验”８。２．２．１２．２．１７鸡源酵母菌的分离纯化７．１培养基的选择麦芽汁培养基２．２．１７．２分离方法健康成年鸡剖杀后，取盲肠内容物ｌｇ置于装ｌＯｍＬ缓冲蛋白胨水的三角瓶中．震荡均匀。１０倍梯度稀释，选３个适宜稀释度各０．ＩｍＬ涂布麦芽汁琼脂平板，３０℃培养４８～７２ｈ。挑选具有酵母菌特征的菌株作为待筛选菌株。——一兰塑型：！：叁兰婴主兰垡堡三２．２．１８鸡源酵母菌的筛选将待筛选菌株活化好后，２５００ｒ／ｍｉｎ离心ｌＯｍｉｎ，重新悬浮于ｐＨ２．５的液体培养基中，调整浓度为ｉ０８个／ｍＬ，３７。Ｃ保温２ｈ，保温前后各取ＩｍＬ稀释后涂布于固体培养基上，３０。Ｃ再培养４８ｈ观察各菌株的菌落生长状况，选择生长良好的菌株作为待测菌株。２．２．Ｉ２．２．１９鸡源酵母菌的特性研究９．Ｉ生长曲线的测定采用２．２．１５．３优化的培养基，方法同２．２．１５，４２．２．２０鸡源酵母菌的初步鉴定２．２．２０１形态鉴定将分离菌株接种于麦芽汁液体培养基中，３０℃培养２４～３６ｈ，观察菌体形态。镜检观察细胞形态、大小和繁殖方式。２．２２０．２生长特性与生理生化鉴定”…１．培养基及材料酵母氮基础培养基：（ＮＨ４）：Ｓ０４５９，组氨酸盐酸盐ｌＯｍｇ，蛋氨酸２０ｍｇ，色氨酸２０ｍｇ，生物素２０氨基苯酸２００ｕｕｕｇ，泛酸２０００ｕｕｇ，叶酸２ＩＪｕｇ，肌醇１００００ｐｕｇ，烟酸４００ｕｕｇ，ｇ，ＶＢ。４００ｇ，，ＶＢ。４００ｕｇ，，核黄酸２００ｉｘｇ，Ｈ３ＢＯ。５００ｇ，ＣｕＳＯ，４０ｕｇ，ＫＩｌ００ｕｇ，ＦｅＣｌ２００ｇ，ＭｎＳ０４４００ｇ，Ｎａ：ＭｏＯ；２００ｕｇ．ＺｎＳＯ。４００ｇ，ＫＨ：ＰＯ，０．８５９，Ｋ：ＨＰＯ。０．１５９，ＭｇＳＯｔ０．５９，ＮａＣｌＯ．１９，ＣａＣｌ２０．１９。麦芽汁培养基玉米粉琼脂培养基尿素琼脂培养基２．液体生长实验将菌种接入装有４０ｍＬ麦芽汁液体培养基的三角瓶中，２５℃下静置培养３天后观察底部有无沉淀及其质地，表面有无膜醭或岛状醭及其质地。３．假菌丝形成实验将菌种接种玉米粉琼脂平板培养基上（平板接种前预先放置ｌ～２天使其表明干燥），接种方法：在平板的一边划直线接种，在中间放一片无菌盖玻片，在相对的另一面点接两点，在其中的一点上放置无菌盖玻片，以保证在菌落的周围营造厌氧环境，有利于假菌丝的形成。于２５℃下静置培养７～ｌＯ天后在显微镜下观察假菌丝的有无及其形态。４．碳水化合物的发酵第二章材料与方法分别将葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖用配制成２０％（ｗ／ｖ）的母液，棉仔糖配制成４０％（ｗ／ｖ）的母液，过滤除菌后置于４。Ｃ冰箱备用。用蒸馏水配制０．５％（ｗ／ｖ）的酵母提取物溶液，分装试管（放置倒置杜氏发酵管），每管３．６ｍＬ，灭菌３０ｍ［ｎ，然后每管加入０．４ｍＬ糖母液。每管接入０．ｔｍＬ的待测菌的菌悬液，摇匀，２５℃培养２周，观察杜氏管内气体积存情况。ｌ～３天气体充满管为“＋”强发酵，有气泡但未充满管为“＋ｗ”弱发酵，没有气泡为“一”不发酵。５．碳源化合物的同化将各种碳源化合物（糖、醇、有机酸）分别配制成１０倍浓度的同化母液，方法为：在６．７９酵母氮基础培养基中分别加入与５９葡萄糖相当的碳源化合物（即与５９葡萄糖含有同样多的碳，如棉仔糖为３碳糖，浓度需加倍，有机酸先把酸度调至ｐＨ５．７），过滤除菌后放入冰箱备用。在试管中加入３．６ｍＬ无菌蒸馏水和０．４ｍＬ同化母液制成同化管。将活化好的菌种的菌悬液滴加入同化管中，２５℃静置培养３周，观察并记录同化结果。方法如下：在一张白色卡片上用黑色墨水划约３～４ｍｍ宽的直线，将同化管摇匀后贴在卡片上观察。若透过试管完全看不见黑线或者可以看见但成一发散的模糊线条，记录为阳性（＋）。若黑线可以看清楚但边缘模糊或者黑线清晰而且边缘不模糊，记录为阴性（一）。６尿酶实验将活化菌种接种于尿素琼脂斜面上，３０℃培养。第ｌ，３，７天后观察，红色为阳性。２．２．２１拮抗病原菌试验２２．２１１培养基及材料待测菌株：鸡源双歧杆菌Ｂ１７１，鸡源乳杆菌Ｍ１６，鸡源屎肠球菌ｗｏｌ９，鸡源地衣芽孢杆菌ＹＢ０２，鸡源酵母菌Ｂ１２１肠道致病菌：鸡大肠埃希菌Ｏ一７８，鸡白痢沙门菌０—７９，金黄色葡萄球菌Ｃ５８０００ＥＭＢ培养基（致病菌培养基）乳糖ｌｇ，２％伊红液２ｍＬ，０．６５％美蓝ｍｔ，ｐＨ７．６的无糖琼脂ｌＯｍＬ（蛋白胨ｌＯｇ，磷酸氢二钾２９，琼脂２０９，蒸馏水１０００ｍＬ）ＤＨＬ培养基（沙门氏菌选择培养基）蛋白胨２０９牛肉膏３９，乳糖ｌＯｇ，蔗糖ｌｏｇ，去氧胆酸钠ｌｇ，硫代硫酸钠２．３９，柠檬酸铁胺ｌｇ，中性红０．０３９，琼脂２０９，蒸馏水１０００ｍＬ调ｐＨ７．３，将除中性红和琼脂以外的成分溶解于４００ｍＬ蒸馏水中，校正ｐＨ，再将琼脂于６００ｍＬ蒸馏水中煮沸溶解，两液合并．并加入０．５％中性红水溶液６ｍＬ待冷至５０～５５℃，倾注平板。Ｂａｉｒｄ—Ｐａｒｋｅｒ氏培养基（金黄色葡萄球菌选择培养基）华南理工大学硕士学位论文胰蛋白胨ｌＯｇ，牛肉膏５９，酵母膏ｌｇ。丙酮酸钠ｌＯｇ，苷氨酸１２９，氯化锂５９，琼脂２０９，蒸馏水１０００ｍＬ２．２．２１．２Ｂ１７ｌ，Ｍ１６，Ｗ０１９抑菌实验叭７ｌ，Ｍ１６，ＷＯｌ９分别在５ｍＬ的ＴＰＹ肉汤培养基中培养１６ｈ后，将实验管：已在ＴＰＹ肉汤中培养６ｈ的肠道致病菌分别取出０．３ｍＬ加入实验管中，然后分别补进２．５ｍＬＴＰＹ肉汤培养基。对照管：致病菌分别单独培养于２５ｍＬ的ＴＰＹ肉汤培养基中，Ｂ１７ｌ，Ｍ１６，Ｗ０１９培养于５ｍＬ的ＴＰＹ肉汤培养基中，菌量与实验管相同。实验管和对照管均在厌氧罐中培养２４ｈ后。通过系列稀释活菌计数法，确定原菌液数量以及加入到实验管和对照管的菌量。计数时，分别从各培养管中取出０．１ｍＬ进行倍比稀释，每个稀释度定量倒ＥＭＢ平板（对照管）和含万古霉素５Ｕ／ｍＬ（抑制厌氧菌）的营养琼脂培养基（实验管）进行活菌计数。２．２。２１，３ＢＢ１７ｌ，Ｍ１６，哟１９杀菌实验Ｌ７ｌ，Ｍ１６，ｗｏｌ９分别在ＴＰＹ肉汤培养基中培养４８ｈ后，４０００ｒ／ｍｉｒｌ离一ＬＩ，ｌＯｍｉｎ取上清液备用。致病菌经普通肉汤培养基增菌６ｈ，调菌液浓度为０．５Ｍｃｆａｒｌａｎｄ作为原液管，同时每株原液各进行１０倍稀释定为稀释管。分别将原液管和稀释管的致病菌均匀涂佰于ＥＭＢ平板表面，置于３５℃平衡干燥３０ｍｉｒｌ，再将备用的效应菌培养上清液分别取０．１ｍＬ点种在涂布了各种致病菌的ＥＭＢ平板上，置于３５℃培养１８ｈ后观察结果，判定上清液点种的范围内是否有致病菌的生长。２．２．２１４ＹＢ０２和Ｂ１２ｌ抑菌实验实验管：将ＹＢ０２和Ｂ１２ｌ和致病菌分别用肉汤培养基活化培养６～８ｈ，调各菌的浓度为１０８个／ｍＬ。分别取ｔｍＬ的待测菌液２ｍＬ的致病菌液混合于２０ｍＬ的肉汤中，３７℃培养。对照管：致病菌和待测菌分别单独培养于２５ｍＬ的肉汤培养基中，菌量与实验管相同。实验管和对照管培养２４ｈ后。通过系列稀释活菌计数法，确定原菌液数量以及加入到实验管和对照管的菌量。计数时，分别从各培养管中取出０．１ｍＬ进行倍比稀释，每个稀释度定量点种ＥＭＢ平板、ＤＨＬ培养基以及Ｂａｉｒｄ—Ｐａｒｋｅｒ进行活菌计数。２．２．２２拮抗抗生素试验２．２．２２．１抗生素药敏片的制备——一茎三至塑型皇立鲨将抗生素根据各自含药量计算，用ｐＨ值６．０的磷酸缓冲液配制成一定浓度的溶液。用１０２型定性滤纸自制成５ｍｍ的圆纸片，干热灭菌，室温保藏。Ｉ临用前，每张滤纸片分别吸取抗生素５～ｌＯｍＬ，制成相应的药敏纸片。２２．２２．２抑菌圈测定将液体纯培养好的待筛菌分别稀释１００倍，各取０．２ｍＬ菌液与培养基混合倒平板。将抗生素药敏纸片均匀间隔放入平板内，并以吸有缓冲液的滤纸片作为对照・３８。Ｃ培养１６ｈ后测定抑菌圈大小（包括药敏纸片直径）。每个处理做３个重复，取平均值。２．２．２３菌株间的拮抗性及相容性２．２．２３．１平板培养法通过对同一平板上不同菌株（鸡源双歧杆菌Ｂ１７ｌ，鸡源乳杆菌Ｍ１６，鸡源屎肠球菌ｗＯｔ９，鸡源地衣芽孢杆菌ＹＢ０２，鸡源酵母菌Ｂ１２１）划线培养的菌苔交点处是否连续，考察菌株间是否有拮抗作用。菌苔交叉紧密的则认为其间无拮抗作用。１培养基牛肉膏３９，葡萄糖１０９．蛋白胨７９，ＮａＣｌ３９，酵母膏５９，琼脂２０９。蒸馏水１０００ｍＬ调ｐＨ７．０，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ２方法将灭菌后的培养基倒入五个培养皿，每个平板考察一种菌株同另四种菌株的相容性。用沾有该菌株的接种环在培养基表面均匀地划出四条平行线，然后分别用沾有另四种菌的接种环在培养基表面均匀地划出与前四条平行线垂直相交的四条平行线，于３７℃培养２４ｈ后观察。２．２．２４菌种保藏ｆ２０％灭菌脱脂奶中，分装入２ｍＬ无菌安培管中，在～３０。Ｃ将菌株在液体培养基中增菌至平衡期，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集菌体分散４０４Ｃ条件下进行冻干，冻干完成后，在酒精喷灯上封口，一１８℃保存”。６…。２．２．２５菌种活化冻干菌种的活化：活化前，将低温保存的菌种室温下放置一天后，用７０％酒精棉球擦拭安培管表面消毒，在酒精灯火焰上方将安培管上部烤热，然后滴加冷的灭菌蒸馏水，使安培管开裂，用镊子敲掉上部，取０。２ｍＬ液体培养基加入安培管中，混匀取出接种于琼脂平板上．最佳培养条件下培养４８～７２ｈ，再连续活化两代或三代，以提高菌株活力。７“…。华南理工丈学硕士学位论文第三章结果与讨论３．１鸡源双岐杆菌的分离纯化及形态观察从４只１５天龄小鸡的盲肠内分离得到４株待筛选菌株（Ｂ２４１．Ｂ１７ｌ，Ｂ０３２，Ｂｌ７７）。通过菌落及菌体形态可以看出，鸡双歧杆菌菌落微小，光滑，乳白色，呈半透明或不透明，边缘整齐，凸起。菌体革兰氏染色呈阳性，并呈多形态性．菌体不规则，传代后，“Ｖ”字形和“Ｙ”字形较少见。结果提示：双歧杆菌的多形态性为从形态上区别和鉴定该菌带来了一定的难度。这种多形态并不是退化，因为这些形态随时可恢复为初始的形态，即杆状与分又状的可逆性变化，这是与培养基有关的一种表型变化。除Ｎ一乙酰葡萄糖胺外，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸与钙离子参与了菌体肽聚糖的合成，这些物质的缺少或低浓度都可出现分叉状，反之则出现杆状。培养基营养越适宜，杆状体越长。３．２鸡源双歧杆菌的筛选３．２．１待筛菌生长活力及产酸能力比较图３一ｌ，３—２，３—３，３—４分别是Ｂ２４ｉ，Ｂ１７ｌ，Ｂ０３２，Ｂ１７７的生长曲线。从生长活力及产酸性能比较，Ｂ１７ｌ无明显的生长迟滞期，产酸能力较强，１８ｈ进入平衡期。其培养终ｐＨ值可接近４．２７，培养结束时，菌液吸光值为１．８８３。故选择ＢＬ７ｌ进行以下的实验研究。２５２８７６５１５ｇＤｏ４掣３。２１，０５Ｏ０４０８１２１６２０２４２８３２３６４０４４４８时间（ｈｒ】图３一ＩＢ２４１的生长曲线和ｐＨ变化曲线Ｆｉｇ．３一ＩＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＢ２４ｉａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｐＨ３０２５２８７６翟１。５１ｉ挈０．５０；４１Ｏ翔１．５ｏｏ菩１．５ｏ００４８１２ｌＧ２０２４２８３２３６４０４４４８时间（ｈ时图３—２Ｂ１７１的生长曲线和ｐＨ变化曲线Ｆｉｇ．３－２ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＢ１７ＩａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｐＨｉｎｇｒｏｗｔｈ２５１８７２６５４１３遥工４０．５０１●２，００４８１２Ｌ６２０２４２８３２３６４０４４４８时间（ｈｎ图３—３Ｂ０３２的生长曲线和ｐＨ变化曲线Ｆｉｇ．３－３ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＢ０３２ａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｐＨｉ“ｇｒｏｗｔｈ２．５８２６１４挈—●卜ＯＤ６００ｎＩ＝！ｇ！ｌＯ．５２０００４８１２１６２０２４２８３２３６４０４４４８时间（ｈＯ图３—４Ｂ１７７的生长曲线和ｐＨ变化曲线Ｆｉｇ．３－４ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＢ１７７ａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｐＨｉｎｇｒｏｗｔｈ——兰苎里兰盔主堕±兰堡垒壅３．３鸡源双歧杆菌的特性研究３．３．１最适初始ｐＨ值８６ｇｏｏ４２７．／——～Ｌ６５ｐＨ图３—５不同初始ｐＨ值对Ｂ１７１生长特性的影响Ｆｉｇ．３－５ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨＯｎｇｒｏｗｔｈｏｆＢｌ７ｌ由图３—５可见．最适初始ｐＨ值为７．０。３．３．２最适培养温度１．８１．６警１．４１．２ｌ３０３５４０４５温度（℃）图３—６不同温度对Ｂ１７Ｌ生长特性的影响Ｆｉｇ．３－６ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｇｒｏｗｔｈｏｆＢ１７１由图３—６可见，最适培养温度为４０＂Ｃ。３．３．３培养基优化３．３．３１氮源的优化按表２一ｌ的因素水平表，采用Ｌ。（３４）正交实验实施实验。实验结果见表３一ｌ，相应的极差分析见表３—２。由表３—２可见，各因素对ＯＤ指标和ｐＨ值指标影响的显著顺序为：Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄ，即酵母膏的影响最为显著，胰蛋白胨次之，大豆蛋白胨再次之，牛肉膏的影响最小。氮源的最优组合是Ａ３如ｃ。Ｄ：。固定显著因素酵母膏的量为０．９％。采用正交实验设计ｂ（３４）优化鸡源双歧杆菌培养基。——兰三兰竺墨皇塑丝——！ａｂｌｅ３一ｌ————————————————————————————————————一．表３一ｌ氮源优化正交实验结果ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｎＬ。（３。）：ｓｏｕｒｃｅ试验号——一里鲞Ａ（％）０．３０．３０．３０．６０．６ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎ塑堡ＯＤ。ＰＨ值０．６５６０．８７５０．８８３０．５７４０．９９３１．１０５Ｂ（％）０．３Ｃ（％）Ｄ（％）０．３０．６０．９０．６０．９０．３０．９０．３０．６０．３０．６０．９０．９０．３０．６０．６０．９０．３Ｌ５．６５５．２２５．０ｌ５．７５４．９ｌ４．３２２３４０．６０．９０．３０．６０．９０．３０．６５６７０．６０．９０．９１．２２６１．３５７１．１２２４．２３４．１０４．２２８９０．９０．９表３—２氮源优化中各指标的极差分析结果Ｔａｂｌｅ３－２ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉＳ指标ＡＫ１０ＤｓｏｏＢ０．８１９Ｃ１．０３９ＰＨ值Ｄ０．９２４１．０６９０．９３２０．１４５Ａ５．３００ＢＣ４．６８７５．０８３Ｄ４．９３７４．４９００．８０５０．８９１１．２３５５．１８３４．５８３４．５７０Ｋ２Ｋ３１．０７５Ｌ０３７０．８５７１．０３４４．９１０４．１２７４．５６７０．５１６４．９１００．４４７Ｒ０．４３００．２５６０．１８２１．１７３０．６１３３．３．３．２培养基优化固定显著因素酵母膏的量为０．９％。按表２—１的因素水平表，采用Ｌ。（３４）正交实验实施实验。测定结果见表３—３，相应的极差分析见表３—４。由表３—４可见，各因素对指标影响的显著顺序为：Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ，即氮源的影响最为显著，生长因子次之，双歧因子再次之，碳源的影响最小。以０Ｄ值为指标时的最优组合为Ａ３Ｂ。Ｃ。Ｄ。，以ｐＨ值为指标时的最优组合为Ａ。Ｂ。ｃ。Ｄ。。因此进行了双歧杆菌的验证实验。结果见表３—５。由验证实验结果可知，Ａ３Ｂ，Ｃ，Ｄ：组合的ｐＨ值显著低于Ａ。Ｂ。Ｃ：Ｄ。组合，而ｏＤ值又高于Ａ。Ｂ。Ｃ：Ｄ．组合。因此．最佳培养基配方为Ａ３Ｂ。ｃ。Ｄ：组合。即酵母膏０．９％．胰蛋白胨０．６％，大豆蛋白胨０．６％，葡萄糖２．５％，双歧因子０．２％，生长因子ｌＯ％。华南理工大学硕士学位论文表３—３鸡源双歧杆菌培养基优化的正交实验结果Ｌ。（３４）Ｔａｂ．３－３ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓＯｆｆｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｕ［ｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ丑ｐｕ／／ｏｒｕｍ试验号Ａ（％）Ｂ（％）因素Ｃ（％）Ｄ（％）指标ＯＤ。。。ＰＨ值表３—４鸡源双歧杆菌培养基优化中各指标的极差分析结果Ｔａｂｌｅ３—４Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｖａｔｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ表３—５验证实验结果Ｔａｂｌｅ３—７ＴｈｅｒｅＳＵｌｔＳｏｆｖｅｒｉｆｉｃａｔｉＯｎ３，３．３．３ＢＩ７１在优化培养基中的生长特性生长曲线见图３—７，ｐＨ值变化曲线见图３—８。由图３—７，３—８可见，Ｂ１７１经过较短的延迟期后即进入对数生长期，到ｔ８ｈ后达到高峰后保持不变，表明此后菌数不再增加。考虑到在对数生长期末、稳定期初可提高其在冷冻干燥过程中的存活率，选择发酵培养时间在１８ｈ。此时Ｂ１７１第三章结果与讨论的增殖菌数可达６．２Ｘ１０８个／ⅢＬ。薯口。＋ＴＰＹ培养基±垡些堡鲞薹０５１０１５２０２５３０时间（ｈｒ）图３—７Ｂ１７１的生长曲线Ｆｉｇ．３－７ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＢ１７ｉ７６．５６署５．５△５４５４３５Ｏ１０２０２５时间（ｈ‘图３—８Ｂ１７１生长曲线测定中ｐＨ值变化曲线Ｆｉｇ．３－８ＴｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｐＨｉｎｇｒｏｗｔｈｏｆＢ１７ｌ３．４鸡源双歧杆菌的初步鉴定３．４．１形态学鉴定待测菌株Ｂ１７ｌ革兰氏染色阳性，在显微镜下观察无芽孢、呈典型“Ｙ”型分又。菌体形态图见图３—９。华南理二厂大学硕士学位沦文图３—９Ｂ１７ｌ菌体形态（×１０００倍）Ｆｉｇ．３－９Ｂ１７１（×１０００）３．４．２生理生化特性鉴定参照凌代文主编的《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中提供的生理生化鉴定Ｂ１７１属双歧杆菌属鸡双歧杆菌种。糖发酵特性及生化鉴定结果见表３—６。表３—６Ｂ１７１菌株糖发酵特性及生化鉴定结果Ｔａｂｌｅ３—６Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｒｌ模式ｓｕｇａｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＢ１７ｌａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｔｒａｉｎ第三章结果与讨论３．４．３高效液相色谱分析高效液相色谱分析显示，发酵液中有乳酸和醋酸存在。乳酸标样色谱图见附录１，乳酸＋醋酸标样色谱图见附录２，双歧杆菌色谱图见附录３。３．５鸡源乳酸杆菌的分离纯化与筛选从４只ＬＯ天龄小鸡的小肠内分离得到１６株待筛选菌株。经脱脂乳凝乳实验和对指示菌株的抑菌实验，筛选出凝乳较快和抑菌活性较强的菌株３株，分别为：Ｍ０９，Ｍ１６，Ｍ５２，见表３—７。由表３—７可知，菌株Ｍ１６的凝乳时间最短，抑菌效果最佳，故选择Ｍ１６进行以下实验。表３—７不同菌株的凝乳时间和抑菌活性比较Ｔａｂｌｅ３—７ＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆＥｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｃｕｒｄｌｉｎｇ—ｔｉｍｅａｎｄｉｎｈｉｈｉｔｉｏｎｏｆｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓ３．６鸡源乳酸杆菌的特性研究由于鸡双歧杆菌，鸡乳酸杆菌同属乳酸菌类，营养要求和发酵特性相近，生产中拟用鸡源乳酸杆菌和鸡源双歧杆菌共同发酵，由于鸡双歧杆菌的发酵和保存要求较鸡乳杆菌严格，故优先考虑鸡双歧杆菌的发酵。采用３，３．２优化的鸡双歧杆菌优化培养基来培养Ｍ１６。生长曲线和ｐＨ值变化曲线见图３一ｌＯ。由图３一ｌＯ可见，Ｍ１６到１８ｈ后达到高峰后保持不变，表明此后菌数不再增加。选择发酵时间在１６ｈ。此时Ｍ１６的增殖菌数可达７．１×ｔ０８个／ｍＬ。３７毕雨理工大学帧士掌位论文１１８６７６５６５５５１４１ｇｏｏ０２，８４遥工ａ５４０６Ｏ４Ｏ２００翌ｇｒｏｗｔｈ３５３４８１２１４Ｌ６１８２０２４时间（ｈ叶图３一ＬＯＭ１６的生长曲线和ｐＨ值变化曲线Ｆｉｇ．３－１０ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＭ１６ａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｐＨｉｎ３．７鸡源乳酸杆菌的初步鉴定３．７．１形态学鉴定待鉴定菌株Ｍ１６革兰氏阳性，无芽孢杆菌，大小为（Ｏ．６～０．７）ｌａｍ×（３．８～４．５）帅，单生，成对或呈链状，无鞭毛，不能运动。菌体形态见图３—１ｌ。图３一儿Ｍ１６菌体形态（×ｔ０００倍）Ｆｉｇ．３－ｌｌＭ１６（×１０００）３．７．２生理生化特性鉴定参照凌代文主编的《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中提供的生理生化鉴定模式，待测菌株Ｍ１６属嗜酸乳杆菌。耱发酵及生化鉴定结果见表３—８。表３—８Ｍ１６菌株糖发酵特性及鉴定结果Ｔａｂｔｅ３—８ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓＯｎｓｕｇａｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｌｅｄｒｅｓｕｌｔＳｏｆＳｔｒａｉｎｏｆＭ１６３．７．３ＲａｐｉｄＩＤ３２Ａ生化鉴定法国梅罩埃ＲａｐｉｄＩＤ３２Ａ生化鉴定结果为嗜酸乳杆菌。见图３—１２。ＡＰＩ签定幕嚣：１２３瓣母憎．，＿害陀孝二０４ｆ３口１３７口５ｒａｐｉｄ，疗３２ｒｌ０ＲＥ—ＡＤＩＩ—ａ（１ＡＬ一８６＾Ｌ一８Ｇｐ—ａＧＬ驻＋一ｌＨｏ—ｐＡ乙一ＢＮＡＧｔ＊＆Ｅ＋ＲＡＦ—ＮＩｔ肋Ｐ』ｆＺｅｕＡ＋ＰＹ配４一ＴｙｒＡ●Ａｔａ．４＋ＧＩｙＡ＋芹ｉｓＡ’ＧＧ，４一ＳｅｒＡ＋ＢＧＬＥ＋ａＡＲ＾一８８ＵＲ＾ｒ９Ａ＋ＰｒｏＡ—ＬＧ＾６ＢＣ—ａＦ毯ｃ一８一％ｇ一一一：：：一：：：＝姆钧鉴定锫聚ｌ■麓再秆蕾…………………．…．．Ｉｉｄ－－９８．扣口・９２ｆ………：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：～…………………一、畸虢巍耔謦：不苻试验教。ｌＬ誊透莽虐磨事重球毒…・一…・一。・””“。ｉ“。彪ｄ’Ｌ扣玑…．一…．一。。“菇；“。．麒ｄ，１．ｊ鄙．７８ｋ．ｆ＾＿簪事重球毒Ｉ∥一ＧＡＤｔＣＴＯＳｔＤＡＳＦ删￡？ＳＸ图３—１２ＲａｐｉｄＩＤ３２Ａ生化鉴定结果Ｆｉｇ．３—１２ＴｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｒｅｓｕｌｔｏｆｒａｐｉｄＩＤ３２Ａ３．７．４高效液相色谱分析华南理工大学硕士学位论文高效液相色谱分析显示，发酵液中有乳酸存在。乳酸杆菌色谱图见附录４。３．８鸡源屎肠球菌的分离纯化与筛选从３０天龄鸡的盲肠内分离得到２株待筛选菌株。通过菌落及菌体形态可以看出，鸡屎肠球菌液体培养基中呈沉淀生长，无菌膜形成，固体培养基菌落光滑、周边整齐，直径０．５～１．５ｍｍ。是羡性厌氧革兰氏阳性菌。经筛选，确定ｗＯｌ９作为待测菌株。３．９鸡源屎肠球菌的特性研究由于屎肠球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌同属乳酸菌类，营养要求和发酵特性相近．生产中拟用鸡源屎肠球菌、鸡源乳酸杆菌和鸡源双歧杆菌共同发酵，优先考虑鸡源双歧杆菌的发酵。采用３．３．２优化的双歧杆菌培养基来培养ｗ０１９。生长曲线和ｐＨ值变化益线见图３一１３。由图３—１３可见，ｗｏｌ９的发酵时间为１６ｈ，此时的增殖菌数可达８．３×１０８／ｍｌ。２８７６．５６６４型凸ｏ２１８６４ｓｓ翟：≯△—二—！－５４．５４０４８２Ｏ１２ｌ４１６ｔ８２０２４时间（ｈｒ）图３—１３Ｗ０１９的生长曲线和ｐＨ值变化曲线Ｆｉｇ．３－１３ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＷＯｌ９ａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｐＨｉｎｇｒｏｗｔｈ３．１０鸡源屎肠球菌的初步鉴定３．１０．１形态学鉴定菌株Ｗ０１９革兰氏染色呈阳性，球菌。大小为０．５－－１．５帅，成对、单个或呈链状排列，无鞭毛，荚膜和芽孢．不能运动。菌体形态见图３—１４。４０第三章结果与讨论图３—１４Ｗ０１９菌体形态（×１０００倍）Ｆｉｇ．３一１４Ｗ０１９（×１０００）３．１０．２生理生化特性鉴定生长特性：液体培养基中呈沉淀生长，无菌膜形成，固体培养基菌落光滑、周边整齐，直径０．５～１．５ｍｍ。生长试验、生化代谢及其糖发酵特性实验结果见表３—９。根据鉴定结果，Ｗ０１９是屎肠球菌。表３—９Ｗ０１９菌株生长实验及生化鉴定结果Ｔａｂｌｅ３—９ＣｈａｒａｃｔｅｒｉＳｔｉＣＳｏｎｇｒｏｗｉｎｇｔｅｓｔａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｒｅＳＵｌｔＳｏｆＷ０１９１蔗乳肌尿篡磊；茹姜蕃Ｗ０１９＋＋一一一乳甘露糖蜜二糖粥媳峨钠隅氧酸＾一＋松三糖核糖七叶苷木糖纤维二糖＋＋一＋＋＋一＋阿拉伯糖＋一一一一淀粉菊糖山梨醇丙酮酸Ｎ眺酊眦珈，．ｃ＋＋３．１０．３高效液相色谱分析４１华南理工大学硕士学位论文高效液相色谱分析显示，发酵液中有乳酸存在。屎肠球菌色谱图见附录５３．１１鸡源地衣芽孢杆菌的分离纯化及筛选从３０天龄鸡的盲肠内分离得到２株待筛选菌株ＹＢ０２．ＹＢ０３２。鸡源地衣芽孢杆菌革兰氏阳性，芽孢中生，椭圆形，运动，菌体形态受温度、培养基和培养时间等因素影响变化很大。在营养琼脂培养基表面生长时，菌落不透明．牢固的附着在培养基表面，呈圆形，较粗糙。在琼脂内部生长缓慢，呈小花状菌落，中心有一透明的小点。经拮抗致病菌株（鸡大肠埃希氏菌Ｏ一７８）的抑菌圈比较，选择ＹＢ０２作为待测菌株继续以下实验。拮抗致病菌株的筛选结果见表３一１０。表３一１０拮抗致病菌株的筛选结果Ｔａｂ】ｅ３—１０ＴｈｅＳＣｒｅｅｎｒｅｓｕｌｔＳｏｆｒｅｓｉＳｔ－ｂａｃｔｅｒｉａｓｔｒａｉｎ时间（ｈ）ＹＢ０２（抑菌圈直径／ｍｍ）ＹＢ０３（抑菌圈直径／ｒａｍ）４８１８．００ｉ４．２６３．１３．１２鸡源地衣芽孢杆菌的特性研究２．１最适初始ｐＨ值Ｌ４０。２０一Ｌ号１００一毫８”Ⅱ＊６０一要４０一２０一图３—１５ＹＢ０２培养基ｐＨ值的确定Ｆｉｇｕｒｅ３－１５ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐＨｖａｌｕｅｏｎ一ｇｒｏｗｔｈｏｆＹＢ０２ｔｈｅ由图３—１５可见，最佳初始ｐＨ值为６．５ａ３．１２．２最适培养温度．；ｈｏⅡ引宝一嚣刊毫｝如∞∞∞如如０２０２５３０３５４０４５５０温度（℃）图３—１６ＹＢ０２生长与温度的关系图Ｆｉｇｕｒｅ３－１６ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＹＢ０２由图３一１６可见，最佳培养温度为３０～３２℃。３．１２．３培养基优化碳源对ＹＢ０２生长的影响见表３一ｌｌ表３一ｌｌ碳源对ＹＢ０２生长的影响Ｔａｂ．３—１ｌＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎ３．１２，３，１碳源的优化ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＹＢ０２从表３—１ｌ可以看出，最适合ＹＢ０２生长的碳源是玉米淀粉，其次是可溶性淀粉。３１２．３．２氦源的优化氮源对ＹＢ０２生长的影响见表３—１２表３一１２氮源对ＹＢ０２生长的影响Ｔａｂ．３—１２ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＹＢ０２华南理工．大学硕士学位论文从表３一１２可以看出．有机氮源较无机氮源更有利于ＹＢ０２的生长。最佳为酵母膏，其次是蛋白胨和蛋白胨＋酵母膏。３１２３．３无机盐的优化无机盐对ＹＢ０２生长的影响见表３一１３表３—１３无机盐对ＹＢ０２生长的影响Ｔａｂ．３一１３ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｉｎｅｒａｌｏＮｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＹＢ０２从表３一１３可以看出，磷是ＹＢ０２生长必须的元素，磷在菌体的核酸代谢、能量的储存与传递方面起着重要的作用。同时，磷酸盐也是重要的缓冲剂。３１２．３．４生长因子的优化玉米浆富含生长因子，能促进菌株的生长，其添加量对ＹＢ０２生长的影响见图３一１７。从图３一１７可以看出玉米浆对菌株ＹＢ０２的生长有明显的促进作用，添加量以２％～２．５％最佳。３５０３００ｊ２５０童２００Ⅱ目１５０彝划１００５０ＯＬ５２２．５３３．５玉米浆浓度（％）图３—１７玉米浆对ＹＢ０２生长的影响ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏｒｎｓｙｒｕｐｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＹＢ０２第三章结果与讨论３．１２３．５鸡源地衣芽孢杆菌培养基的优化以酵母膏、玉米淀粉、ＮａＨ２Ｐ０４＋Ｎａ２ＨＰＯ４和玉米浆作为发酵因素，按表２—３的因素水平表，采用ｂ（３４）正交实验实施实验。实验结果见表３一１４，相应的极差分析见衰３—１５。由表３一１５可见，各因素对指标影响的显著顺序为：Ｃ＞Ｂ＞Ａ＞Ｄ，即无机盐的影响最为显著，碳源次之，氮源再次之，生长因子的影响最小。最优组合为Ａ。Ｂ：Ｃ：Ｄ：，即酵母膏为１．ｊ％，玉米淀粉２．０％，ＮａＨ２Ｐ０４＋Ｎａ２ＨＰ０４０．２％＋０．２％，玉米浆２．０％。表３—１４ＹＢ０２培养基优化的正交实验结果Ｌ。（３４）Ｔａｂ．３—１４ＴｈｅｒｅｓｕＬｔＳＯｉｌＯｐｔｉｍｉｚａｔｉＯＩ＇ＩｏｆＣＵｌｔｕｒｅｗｉｔｈＹＢ０２试验号Ａ（％）１．Ｏ１．０１．０１．５１．５１．５２．Ｏ２．Ｏ９２．０因素Ｂ（％）１．Ｏ２．０３．Ｏ２．０３．０Ｌ．０３．０１．Ｏ２．０生物量（１０９个／ｍＬ）Ｃ（％）Ｄ（％）１ｌ２３２３１３ｌ５２０２５２５ｌ组２２０２４ｌＯ８８２３６ｌ６Ｏ２ＯＯｌＯＯ２ｌ５１．８３２组ｌ８７２５３Ｏ９３２ｌ总和４４Ｏ７９４吼ｍ２３２ｍ吼ｍ３ｌ３ｍ吼吼ｌｌ８１４６９３２９４２６２５７３３６９２６ｌ５２Ｏ２２０２５１．５ｌ５７ｌ８Ｏ２．０５均加加如加均加地ｌ３９５３．８５０．２＋０．２表３一１５鸡源地衣芽孢杆菌培养基优化中各指标的极差分析结果Ｔａｂｌｅ３—１５ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＢ３．７７７４．０６０３．３０７０．７５３ｖａｒｉａｎｃｅａｎ８ｌｙｓｉＳＣ４．０９３４．４９３２．５５７１．９３６Ｄ３．７３７３．９２３３．４８３０．４４０指标ＫｌＫ２Ｋ３ＲＡ３．６０７４．０８０３．４５７０．６２３３．１２．３．６ＹＢ０２在优化培养基中的生长特性生长曲线见图３—１８华南理工大学硕士学位论文３皇＜－％：ｌ刹Ｉ＋含孢于：『—卜不含孢于蛎∞强∞筠绚’三ｍ００１０１５２０２５３０３５彝刊时间（ｈｒ）图３—１８ＹＢ０２的生长曲线Ｆｉｇ．３—１８ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＹＢ０２从生长曲线可知，ＹＢ０２在１２～１５ｈ左右菌种生长基本处于稳定期。在１７～２０ｈ时，有芽孢形成并大量产生孢子。因孢子具有耐高温、耐挤压的性能，较长时问保持活力，故选择种龄在１４～１６ｈ，发酵时间在１８～２０ｈ。此时ＹＢ０２的增殖数可达３。５×１０９个／ｍＥ。３．１３．１３鸡源地衣芽孢杆菌的鉴定３．１形态学鉴定菌株ＹＢ０２菌体大小为２．２～２．５ｕｍ×０．６５～０．７５ｕｍ，芽孢中生，椭圆形。菌体形态：圆形，乳白色，边缘整体、凸起，表面不很光滑，湿润，不透明。菌体形态见图３一１９。图３—１９ＹＢ０２菌体形态（×１０００倍）Ｆｉｇ．３－１９ＹＢ０２（×１０００）第三章结果与讨论３．１３．２生理生化特性鉴定表３—１６ＹＢ０２菌株生长实验及生化鉴定结果Ｔａｂｌｅ３—１６ＣｈａｒａｃｔｅｒｉＳｔｉＣＳ０１１ｇｒｏｗｉｎｇｔｅｓｔａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｒｅｓｕｌｔＳｏｆＹＢ０２菌株ＹＢ翼銎Ｌ－兰嘉｜｜囊Ｖ管｛爹罨爹蒌垂嚣鍪≤≥罨孑＋＋一＋＋＋＋５．８一０２利利酪素水明胶粉柠二成淀用晶生ＨＨ解化解酸：哚“±ｈ液水檬雾吲＋＋＋＋一民生８长曩生７长№生％ｍ长№生％吼长，№生％叭长最生温高长度最生温低长度＋＋＋＋＋＋５５℃１５℃根据以上鉴定结果，ＹＢ０２是地衣芽孢杆菌。３．１４鸡源酵母菌的分离纯化和筛选从成年鸡的盲肠内分离得到１２株待筛选菌株。经热稳定性筛选试验，选择菌株Ｂ１２ｌ进行以下实验。３．１５鸡源酵母菌的特性研究考虑到生产中鸡源酵母菌将和鸡源地衣芽孢杆菌共同发酵，采用３．１２．３．５的鸡源地衣芽孢杆菌优化培养基来培养Ｂ１２１。生长曲线见图３—２０。从生长曲线可知，Ｂ１２１在１８ｈ左右菌种生长基本处于稳定期。故选择种龄１４～１５ｈ，发酵终止时间１８～２０ｈ。此时Ｂ１２１增殖数可达１．２４Ｘ１０８个／ｍＬ。４７华南理工大学硕士学位论文４２Ｏ８６４２００５１０１５２０２５３０｜二、三鼎二Ⅲ屯时间（ｈｒ）图３—２０Ｂ１２１的生长曲线Ｆｉｇ．３—２０ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＢ１２ｌ３．１３．１６鸡源酵母菌的初步鉴定６．１形态学鉴定菌株Ｂ［２ｌ菌落呈奶油色，质地粘稠，表面光滑无纹，边缘光滑。细胞呈椭圆ｍ．繁殖方式为单极芽殖。菌体形态见图３—２ｌ。大小２．１～４×３～７ｕ图３—２１Ｂ１２１菌体形态（×１０００倍）Ｆｉｇ．３－２１Ｂ１２ｔ（×１０００）髓——３．１苎三兰堕墨量盟笙６．２生长特性与生理生化鉴定液体生长特征表明，该菌生长有沉淀，质地致密，无膜醭。无假菌丝形成。碳水化合物发酵和碳源化合物的同化结果见表３一１７。表３—１７Ｂ１２１菌株生化鉴定结果Ｔａｂｌｅ３—１７ＩｄｅｎｔｉｆｉｅｄｒｅｓｕｌｔｓｏｆＢ１２ｌ墨ｉ｜嘉喜蚕凳量嚣薯蓑磊蓑蕃墨Ｄ一鼠李菌株Ｂ１２ｌ半乳糖蔗糖Ｌ山梨糖麦芽糖乳糖纤维二糖蜜二糖棉仔糖哺僦粉阻木糖旧黼糖核糖糖同化萎嚣嘉薹薹６，Ｗ０１９抑菌实验根据以上鉴定结果，参照《酵母菌的特征与鉴定手册》的有关描述，Ｂ１２ｌ是酵母菌属。３．１７拮抗病原菌试验Ｂ１７１，Ｍ１３．１７．１在同类实验中，常常采用待测菌和致病菌均同时加入被观察的培养系统同培养。而在本实验中，考虑到厌氧菌的生长周期较长，繁殖速度慢，如果同时进入新的培养系统中，致病菌在经过短暂的适应期后将迅速生长．在营养和生长空间的竞争方面处于优势，使厌氧菌的生长和代谢受到影响，从而不能完全体现它对致病菌的生长抑制作用。在本实验中，采用模拟肠道生境的方法，即先有益生菌，后有外籍菌。当待测菌在实验管中培养了１６ｈ后，正值对数生长期，再将同样处于对数期的致病菌华南理上大学硕士学位论文加入其中，并补充三分之一的培养基，以提供致病菌足够的营养，有利于致病菌的生长。双歧杆菌ＢＩＴｌ，嗜酸乳杆菌Ｍ１６，屎肠球菌ＷＯｌ９抑菌实验结果见表３—１８。表３—１８菌株Ｂ１７１．Ｍ１６，Ｗ０１９抑菌实验结果Ｔａｂ．３一ｔ８ＴｈｅｒｅｓｕｌｔＳｏｆｒｅｓｉｓｔ—ｂａｃｔｅｒｉａｔｅｓｔｆｏｒＢｉ７ｌ，Ｍ１６．Ｗ０１９待测菌指示菌对照组菌数（个／ｍＬ）实验组菌数（个／ｍＬ）抑制率（％）由表３—１８可知，嗜酸乳杆菌Ｍ１６在体外具有抑制杀死鸡大肠埃希菌Ｏ一７８．鸡白痢沙门菌Ｏ一７９，金黄色葡萄球菌Ｃ５８０００的作用。双歧杆菌Ｂ１７ｌ和屎肠球菌Ｗ０１９对Ｏ一７８，０—７９，Ｃ５８０００均有明显的抑制作用。３．１７．２Ｂ１７１，Ｍ１６，Ｗ０１９发酵上清液的杀菌实验表３一１９菌株Ｂ１７１，Ｍ１６，Ｗ０１９发酵上清液的杀菌实验结果Ｔａｂ．３—１９ＴｈｅｒｅｓｕｌｔＳｏｆｒｅｓｉｓｔ—ｂａｃｌ：ｅｒｉａｔｅｓｔｆｏｒｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ１ｉｑｕｏｒｏｆＢ１７ｌ，Ｍ１６．ＷＯｌ９双歧杆菌Ｂ１７ｌ，嗜酸乳杆菌Ｍ１６．屎肠球菌ＷＯｌ９发酵上清液的杀菌实验结果见表３—１９。第三章结果与讨论结果表明，嗜酸乳杆菌Ｍ１６的上清液对三种鸡肠道致病菌的原液浓度（０．５Ｍｃｆａｒｌａｎｄ）没有杀菌作用，而对１０倍稀释后浓度的细菌表现出杀菌效应，在上清液点种的区域内均无致病菌的生长。提示嗜酸乳杆菌Ｍ１６的代谢产物对三种鸡肠道致病菌有明确的杀菌作用。据报道，不同属、种、株的乳杆菌都能产生不同的细菌素．具有抑制或杀死其他微生物的作用。而乳杆菌发酵产生的大量乳酸，显著降低环境中的ｐＨ值（可达３．５），也是不容忽视的原因之一。双歧杆菌Ｂ１７１和屎肠球菌ｗ０１９的上清液对三种肠道致病菌的原液浓度（０．５Ｍｃｆａｒｌａｎｄ）以及１０倍稀释的细菌均没有杀菌作用。在上清液点种的区域内，致病菌的生长没有受到影响。３．１７．３ＹＢ０２和Ｂｌ２１抑菌实验表３—２０菌株ＹＢ０２和Ｂ１２ｌ抑菌实验结果地衣芽孢杆菌ＹＢ０２和酵母菌Ｂ１２ｌ抑菌实验结果见表３—２０。Ｔａｂ．３～２０Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒｅｓｉｓｔ—ｂａｃｔｅｒｉａｔｅｓｔｆｏｒＹＢ０２ａｎｄＢ１２１从表３—２０结果可以看出，地衣芽孢杆菌ＹＢ０２对鸡大肠埃希菌Ｏ一７８有抑制作用，对鸡白痢沙门菌Ｏ一７９和金黄色葡萄球菌Ｃ５８０００有拮抗作用。地衣芽孢杆菌的代谢产物中有一种类似杆菌肽的物质，对致病菌产生抑制作用。而其较低的氧化还原电位对需氧菌和兼性厌氧菌生长也会产生不利影响，在一定程度上可以降低致病菌的代谢速率，使其生长缓慢甚至死亡。酵母菌Ｂ１２ｌ对三种鸡肠道致病菌有拮抗作用。这可能是通过生长竞争或产物形式实现的。３．１８拮抗抗生素试验双歧杆菌Ｂ１７１、嗜酸乳杆菌Ｍ１６、屎肠球菌ＷＯｌ９、地农芽孢杆菌ＹＢ０２和酵母菌Ｂ１２１的抗生素敏感性实验结果见表３—２ｌ、表３—２２、表３－２３，表３—２４、表３～２５。５１华南理Ｔ大学硕士学位论文表３－２ｌ菌株Ｂ１７ｌ抗生素敏感性实验Ｔａｂ．３－２ｌＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｅｓｔｆｏｒＳｔｒａｉｎＢ１７１抗生素名称Ｌ抑菌圈大小（ｍｍ）评估２３平均表３—２２菌株Ｍ１６抗生素敏感性实验Ｔａｂ．３－２２ＴｈｅｒｅｓｕｌｔＳｏｆｄｒｕｇ—ｒｅＳｉＳｔａｎｃｅｔｅｓｔｆｏｒｓｔｒａｉｎＭ１６抗生素名称林可霉素庆大霉素３６２３１１抑菌圈大小（ｍｍ）２３４３３３——评估平均３４．３２２．６敏感２１８１２６２４１０９４敏感耐药耐药耐药丁胺卡那霉素新霉素９．７１０．７儿６环丙沙星５．３表３—２３菌株ＷＯｉ９抗生素敏感性实验Ｔａｂ．３－２３Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｅｓｔｆｏｒＳｔｒａｉｎＷ０１９抗生素名称抑菌圈大小（ｍｍ）３６１０２０２３１７ｌＯ１２１８２４２０７１ｌ——评估平均７．７１１．０２０．０２３．０１９．３林可霉素丁胺卡那霉素庆大霉素耐药耐药敏感２２２２２１万古霉素敏感敏感氨卞青霉素第三章结果与讨论表３—２４菌株ＹＢ０２抗生素敏感性实验Ｔａｂ．３－２４Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｅｓｔｆｏｒｓｔｒａｉｎＹＢ０２抗生素名称抑菌圈大小（ｍｍ）广——丁——百——１酉～评估表３—２５菌株Ｂ１２ｌ抗生素敏感’陛实验Ｔａｂ．３－２５Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｄｒｕｇ—ＥｅｓｉｓｔａｎｔｅｔｅｓｔｆｏｒｓｔＦａｉｎＢ１２ｌ由以上结果可知，双歧杆菌Ｂ１７ｌ对丁胺卡那霉素、新霉素、巴龙霉素耐药，对青霉素、万古霉素、林可霉素和杆菌肤敏感。嗜酸乳杆菌Ｍ１６对丁胺卡那霉素、新霉素、环丙沙星耐药，对林可霉素、庆大霉素敏感。屎肠球菌ｗＯｌ９对林可霉素、丁胺卡那霉素耐药，对庆大霉素、万古霉素、氨卞青霉素敏感。地衣芽孢杆菌ＹＢ０２对林可霉素、磺胺嘧啶耐药，对庆大霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星、氨卞青霉素、新霉素敏感。酵母菌Ｂ１２ｌ对环丙沙星、林可霉素、新霉素、杆菌肽耐药。３．１９菌株间的拮抗性及相容。性菌株问的拮抗性及相容性实验结果显示，培养基划线的交点处菌苔交叉紧密，说明５种菌株间没有拮抗作用。且双歧杆菌是严格厌氧菌，嗜酸乳杆菌和屎肠球菌是兼性厌氧菌，酵母菌和地衣芽孢杆菌是好氧菌，它们可以互利共生。华南理工人学硕士学位论文结论与展望一、结论本论文主要研究了从鸡的肠道中分离筛选出五种肠道菌，初步鉴定为肠道益生菌，在此基础上对各菌株的培养特性进行探讨。并对各菌株拮抗致病菌和拮抗抗生素的特性进行了探讨。同时也探讨了各菌株之间的拮抗性。总结如下：１．选用ＢＳ培养基，从１５天龄鸡的盲肠中分离筛选出双歧杆菌。选用ＳＬ培养基，从１０天龄鸡的小肠中分离筛选嗜酸乳杆菌。选用ＥＣ培养基，３０天龄鸡的盲肠中分离筛选尿肠球菌。选用ＢＬＩ培养基，从３０天龄鸡的盲肠中分离筛选出地衣芽孢杆菌。选用麦芽汁培养基，从成年鸡的盲肠中分离筛选出酵母菌。２．对分离的五种菌株进行初步鉴定：菌株Ｂ１７１是双歧杆菌，菌株Ｍ１６是嗜酸乳丰Ｔ蔺，菌株ｗ０１９是屎肠球菌，菌株ＹＢ０２是地衣芽孢杆菌，菌株Ｂ１２１是酵母菌。３．双歧杆菌最初从小鸡肠道中分离时严格厌氧，自制厌氧罐不能满足其厌氧要求。厌氧发生袋法可以达到很好的厌氧环境，此方法操作简单易行，适用于双歧市Ｉ‘菌的分离和培养。４．双歧杆菌为革兰氏阳性严格厌氧菌，其最佳培养条件是初始ｐＨ值７．０，初始温度为４０℃。优化培养基配方为酵母膏０．９％，胰蛋白胨０．６％，大豆蛋自胨０．６％．葡萄糖２，５％，双歧因子０．２％，生长因子１０％。选择发酵培养时问为１８ｈ，此时Ｂｉ７ｌ的增殖菌数可达６．２×１０５个／ｍＬ。５．嗜酸乳杆菌Ｍ１６为革兰氏阳性兼性厌氧菌，发酵培养时间为１６ｈ，增殖菌数可达７．１×１０８个／ｍＬ。６．屎肠球菌ｗ０１９为革兰氏阳性兼性厌氧菌，发酵培养时间为１６ｈ，增殖菌数可达８．３Ｘ１０８／ｍｌ。７．地衣芽孢杆菌ＹＢ０２革兰民阳性好氧菌，其最佳培养条件是初始ｐＨ值６．５，培养温度３０～３２℃。优化培养基为酵母膏１．５％，玉米淀粉２．Ｏ％，Ｎａｉｌ２Ｐ０４＋Ｎａ２ＨＰＯ４０．２％＋Ｏ．２％，玉米浆２．０％。发酵培养时间在１８～２０ｈ，此时增殖菌数可达３．５×１０９个／ｍＬ。８．酵母菌Ｂ１２１的发酵培养时间１８～２０ｈ，此时增殖菌数可达１．２４×１０８个／ｍＬ。９。拮抗病原菌实验表明，嗜酸乳杆菌Ｍ１６在体外具有抑制杀灭鸡大肠埃希菌Ｏ一７８，鸡自痢沙门氏菌Ｏ一７９，金黄色葡萄球菌Ｃ５８０００的作用。双歧杆菌Ｂｌ７ｌ和屎肠球菌Ｗ０１９对三种致病菌均有明显的抑制作用。地衣芽孢杆菌ＹＢ０２对０—７８有抑制作用，对Ｏ一７９和Ｃ５８０００有拮抗作用。酵母菌Ｂ１２１对Ｏ一７８、Ｏ一７９和Ｃ５８０００有拮抗作用。ｌＯ．拮抗抗生素实验表明，双歧杆菌Ｂ１７ｌ对丁胺卡那霉素、新霉素、巴龙霉结论与展望素耐药，对青霉素、万古霉素、林可霉素和杆菌肽敏感。乳酸杆菌Ｍ１６对丁胺卡那霉素、新霉素、环丙沙星耐药，对林可霉素、庆大霉素敏感。屎肠球菌Ｗ０１９对林可霉素、丁胺卡那霉素耐药，对庆大霉素、万古霉素、氨卞青霉素敏感。地衣芽孢杆菌ＹＢ０２对林可霉素、磺胺嘧啶耐药，对庆大霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星、氨卞青霉素、新霉素敏感。酵母菌Ｂ１２１对环丙沙星、林可霉素、新霉素、杆菌肽耐药。１１．本实验分离的５种菌株之间没有拮抗作用。二、展望与设想ｌ本实验从鸡肠道中直接分离并初步鉴定了５个菌种：双歧杆菌、乳酸杆菌、屎肠球菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌。它们均为美国食品与药物管理局和美围饲料协会公布的对动物无致病性、可直接用于动物饲料的菌株。２目前，用于动物微生态制剂的菌株大多来源于人和哺乳动物的肠道，或来自于土壤中，而从健康鸡肠道中分离正常菌群的工作还进行得很少。本实验分离菌株均直接分离自健康鸡的肠道，对宿主动物肠道的粘附作用也有种属特异性，有利于在宿主肠道巾的定植。为研制动物微！Ｊ三态制剂提供了合适的菌种。同时为鸡的肠道微生念环境研究提供了资料。３由于条件和资剃有限，本次实验对已初步鉴定的５种菌种没有进行肠道黏ｆ：ｆ＇ｊ实验和动物安全实验。对于酵母菌，还没有确定属于哪一个种。发酵工艺条件的摸索和微囊化保存的研究等工作有待今后进一步完成。４本实验筛选的五种益生菌对三种鸡肠道致病菌有不同程度的拮抗作月；ｊ，鸡源乳酸杆菌对三种鸡肠道致病菌有明显的抑制作用。今后将对它们的抑菌机制、相关的生物特性、相互排斥以及在宿主体内定居等方面进行实验，为研制复合型微生态制剂提供实验依据。５动物微生态制剂的研究方向可以从以下几方面考虑：５．１遗传的稳定性和安全性。５．２基础研究方面有待进一步深入，如利用悉生动物研究益生菌的作用机理。５．３抗生素和微生态制剂联合应用的相互影响程度。５．４用本动物或实验动物做急性、亚急性毒性实验，致畸致残实验，选择安全性好的菌株作为生产菌株。５．５益生菌与益生元、抗生素、酶制剂协调效应和作用机理。５．６从菌株保存技术、厌氧技术、包装和缓释技术、基因工程技术等方面进行生产工艺的研究。５．７采用随机扩增ＤＮＡ多态性分析技术（ＲＡＰＤ：ＲａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉＣＤＮＡ）对同一种属的不同菌株进行鉴别，可以确定菌种来源。防止各微生态制剂中菌株的重复使用，以及各生产厂家的互相抄袭。华南理工大学硕士学位论文参考文献［１］何明清．动物微生态学．第一版．农业出版社，１９９４：１９～２２９［２］谭支良．动物胃肠道微生态理论与实践．应用生态学报．２００３，１４（１）：１４８～［５０［３］ＦｕｌｌｅｔＲ．Ａｒｅｖｉｅｗ：ＰｒｏｂｉｏｔｉｃｓｉｎＢａｃｔｅｒｉａ，Ｉ．９８９，６６：３６５～３７８ｍａｎａｎｄａｎｉｍａｌＳ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｌｅｄ［４］康白．微生态学．第一版．大连出版社，１９８８：２０…［６】王建华．动物肠道菌群与微生态制剂．天津畜牧兽医．１９９６，１３（２）：９～１０［７］何明清．仔猪消化道不同位点的正常菌群与下痢菌的关系．四川Ｉ农学院学报．１９８３，Ｉ（２）：２４３～２４９［８］裴青生．成年鸡盲肠正常菌群的初步研究．青海畜牧兽医杂志．１９９７．２７（５）：６～８［９］杨增岐．健康鸡嗉囊和盲肠内容物正常菌群的分离与鉴定．畜牧兽医杂志．ｔ９９８，２９（１）：４５～５３［１０］ＴｏｒｒａｌｌａｒｄｏｎａＤ，ＨａｒｒｉＳＣ１．Ｔｈｅｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ０ｆｔｈｅＩＶＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｒｌａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍｆｏｒＤｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆＰｉｇｓ．Ｃｈｅｎｇｄｕ：ＳｉｃｈｕａｎＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｅｓＳ．１９９７：２４７～２５０［１１］ＢｅｒｍｈａｒｄＥｃｋｅｌ．益生素改善肠道微生物平衡和饲料卫生．国外畜牧科技．２０００，２７（５）：２ｌ～２２［Ｌ２］石现瑞，高峰．抗生素添加剂的负面效应及其替代品的研究．饲料博览，２０００，１２（３）：２４～２６［１３］杨景云．肠道菌群与健康．第一版．黑龙江科学技术出版社，１９９ｌ：２０～２２［１４］姜文侠，史连生等．饲用微生态制剂一一益生素．动物科学与动物医学．２０００，１７（２）：５７～５９［１５］王丽娟．益生菌的研究及应用进展，饲料博览．１９９９，ｌｌ（１）：１５～１８［１６］ＴａｌａｒｉＣＯＴｄｒａｔａｓｅＬ。ｅｔａ１．ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌｄｅｈｙｆｒｏｍＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ．ＰｏｕｌｔｙＳｃｉｅｎｃｅ．１９９７。７６（１）：１７９～１９６Ｉ．ｅｔａ１．Ｓｕｒｆａｃｅｉｎｓｕｇａｒｓ［１７］ＯｆｅｋｏｆａｎｉｍａｌｃｅｌｌｓａＳａｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｏｆｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｂａｃｔｅｒｉａｌａｄｈｅｒｅｎｃｅ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ．１９８８．３３（２）：３３～４６［１８］ＰｅｄｅｒｓｅｎＫ，ｅｔａ１．ＣｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰｏｒｅｉｎｅｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔｂｙＬａｃｔｏｌｂａｃｉｌｉ．ＡｐｐｌｌｅｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９８９，５５（２）：２７９～２８３［１９］张勇．动物微生态营养及．畜禽业．１９９９，１１（９）：２６～２８［２０］蔡辉益，霍启光．动物营养研究进展．第一版．中国农业科技出版社。１９９４：２３９～２４７参考文献［２Ｌ］江永才．酵母及其共生菌在饲料工业的应用．上海饲料．１９９８，２０（５）：２９～３０［２２］冯亚强．芽孢杆菌微生态制剂的应用进展．中国饲料．１９９５．１０（１０）：８～１０［２３］ＳｏｒｏｋｕｌｏｖａｆｕｎｃｔｆｏｎａｌＩＢ．ＥｆｆｅｃｔｏｆｐｒｏｂｉｏｔｉＣＳｆｒｏｍｂａｃ“Ｌｉｏｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＡｎｔｉｂｉｏｔＫｈｉｍｆｏｔｅｒ．１９９８，４３（２）：２０～２３［２４］王斌．微生态调节剂对鲤鱼生长及肠道菌群的影响．中国微生态学杂志．１９９６。８（１）：３２～３５［２５］胡东兴．微生态制剂及其作用机理．中国饲料．２００１，３：１４～１６［２６］王旭明．益生菌作用机理的研究进展．吉林农业科学．２００２，２７（１）：５０－－５３［２７］ＳｐｉｅｌｅｒＡ，ｅｔａ１．ＬａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｌａｓｐｒｏｂｉｏｔｉＣＳｆｅｅｄａｄｄｉｔｉｖｅ．Ｋｒａｆｔｆｕｔｔｅｒ．１９９６，５：２００～２０７［２８］全艳玲．地衣芽孢杆菌对有害微生物的拮抗作用．食品科学．２００２，２３（８）：６７～６９［２９］刘国华．动物微生态理论在饲料工业中的应用．饲料工业．２０００，２ｌ（３）：ｌ～４［３０］张日俊．消化道微生物与宿主营养素的吸收和代谢研究．中国饲料．２００３，２：１１～１４［３１］ＣｏａｔｅｓＭ．ＩｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｙｎｔｈｅｓｉＳｏｆｔｈｅＢｃｏｍｐｌｘｉｎｃｈｉｃｋｓ．ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎ．１９６８．２２：４９３～５００［３２］ＳｅｋｉＲｅＫ．ＡｎａｌＹｓｉＳａｏｆａｎｔｉｔｕｍｏｒｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌＳＳｔｉｍｕｌａｔｅｄＷｉｔｈｃｅｌｌｗａｌｌｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（ＷＰＧ）ｏｆｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔＳ．Ｂｉ０１．Ｐｈａｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，１８：１４８～１５３［３３］王立生，潘令嘉．双歧杆菌对裸鼠腹腔巨嗜细胞产生ＩＬ一１及ＩＬ一６的影响．中国微生态学杂志．１９９８．１０（３）：３４～３８［３４］ＲｏｍｏｎｄＭｏｆＢ，ｅｔａ１．Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｈｕｍａｎｈｅａｌｔｈ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｏｎＥｃｏｌｉｉｎｔｅｓｔｉｎａｌＣＯｉｏｎｉｚａｔｉＯＮ．Ａｎａｅｒｏｂｅ．１９９７．３：１３１～１３６［３５］葛风霞，袁小林．乳酸杆菌对小鼠腹腔巨嗜细胞活化作用及细胞毒作用的初步研究．中国微生态学杂志．１９９８，１０（１）：４５～４６［３６］潘康成，何明清．地衣芽孢杆菌对家兔免疫功能的影响研究．中国微生态学杂志．１９９８，１０（４）：２０４～２０６［３７］ＰｅｓｓｉＴ，ｅｔａ１．ＰｒｏｂｉｏｔｉｃｓｒｅｉｎｆｏｒｃｅｍｕｃｏｓａｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｇｅｎｉｎｒａｔＳ：Ｉｎｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ２３１８ｕｓｅｏｆｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ．１９９８，１２８（１２）：２３１３～［３８］ＲｏｊａｓＭ，ｅｔａｉ．Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｏｆｐｉｇｌｅｔｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｕｓ．ＪｏｕｒｎａｌＡｐｐｌｌｅｄＢａｃｔｅｒｉ０１．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作者：

学位授予单位：

陈琼

华南理工大学

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