(整理)南农细胞生物学6.

第八章 细胞核与染色体

细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞器，是细胞遗传与代谢的中心。自1831年R．Brown首次命名细胞核(nucleus)以来，对于细胞核的研究始终倍受重视。

所有真核细胞，除高等植物韧皮部成熟的筛管和哺乳动物成熟的红细胞等极少数例外，都含有细胞核。一般说来，真核细胞失去细胞核后不久即导致细胞的死亡。细胞核大多呈球形或卵圆形，但也随物种和细胞类型不同而有很大变化。细胞核与细胞质在体积之间通常存在一个大致的比例，即细胞核的体积约占细胞总体积的10％左右，这被认为是制约细胞最大体积的主要因素之十。核的大小依物种不同而变化，高等动物细胞核直径一般为5～10 m，高等植物细胞核直径一般为5～20 m，低等植物细胞核直径约1—4m。

细胞核主要由核被膜、染色质、核仁及核骨架组成(图8—1)。细胞核是遗传信息的贮存场所，在这里进行基因复制、转录和转录初产物的加工过程，从而控制细胞的遗传与代谢活动。 第一节 核被膜与核孔复合体

核被膜(nuclear envelope)位于间期细胞核的最外层，是细胞核与细胞质之间的界膜。由于它的特殊位置决定了它有两方面的功能，一方面核被膜构成了核、质之间的天然选择性屏障，它将细胞分成核与质两大结构与功能区域：DNA复制、RNA转录与加工在核内进行，蛋白质翻译则局限在细胞质中。这样就避免了彼此相互干扰，使细胞的生命活动更加秩序井然；同时核被膜还能保护核内的DNA分子免受由于细胞骨架运动所产生的机械力的损伤。另一方面，核被膜并不是完全封闭的，核质之间有频繁的物质交换与信息交流，这主要是通过核被膜上的核孔复合体进行的。

核被膜在普通光学显微镜下难以分辨，在相差显微镜下，由于细胞核与细胞质的折光率不同，可以看出核被膜的界限，只有在电子显微镜下才能看清核被膜的细微结构。关于核被膜的结构组成，目前有两种看法，一种意见认为核被膜有三种结构组分，即双层核膜、核孔复合体与核纤层(图8—1)。核纤层(nuclear lamina)紧贴内层核膜下，是一层由纤维蛋白构成的网络结构，它与胞质中间纤维、核内骨架有密切联系。当真核细胞用非离子去垢剂、核酸酶及高盐溶液等分级抽提后，核纤层往往与核孔复合体、胞质中间纤维、核内骨架一起被保存下来，成为贯穿于细胞核与细胞质的骨架结构体系；由此又有人认为核纤层不应该属于核被膜的一种结构组分。在这里我们把核纤层放在细胞骨架结构系统中介绍，本节着重介绍核被膜与核孔复合体。

一、核被膜 (一)结构组成 核被膜由内外两层平行但不连续的单位膜构成。面向核质的一层膜被称作内(层)核膜(inner nuclear membrane)，而面向胞质的另一层膜称为外(层)核膜 (outer nuclear membrane)。两层膜厚度相同，均为7．5 nm。两层膜之间有20～ 40nm的透明空隙，称为核周间隙(perinuclear space)或核周池(perinuclear cisternae)，其宽度随细胞种类不同而异，并随细胞的功能状态而改变。内、外核膜各有特点：①外核膜表面常附有核糖体颗粒，且常常与糙面内质网相通连，使核周间隙与内质网腔彼此相通。从这种结构上的联系出发，外核膜可以看作是糙面内质网的一个特化区域。②内核膜表面光滑，无核

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糖体颗粒附着，但紧贴其内表面有一层致密的纤维网络结构，即核纤层。内核膜上有一些特有的蛋白成分，如核纤层蛋白B受体(1amin B receptor，LBR)。 双层核膜互相平行但并不连续，内、外核膜常常在某些部位相互融合形成环状开口，称为核孔(nuclear pore)。在核孔上镶嵌着一种复杂的结构，叫做核孔复合体。核孔周围的核膜特称为孔膜区(pore membrane domain)，它也有一些特有的蛋白成分，如核孔复合体特有的跨膜糖蛋白gp210、Poml21等。 (二)核被膜在细胞周期中的崩解与装配

在真核细胞的细胞周期中，核被膜有规律地解体与重建。在期，双层核膜崩解成单层膜泡，核孔复合体解体，核纤层去装配；到末期，核被膜开始围绕染色体重新形成。那么，子细胞的核被膜是来源于旧核被膜碎片?还是来自其他膜结构?对此一直有两种意见。通过对变形虫的研究，很多人支持第一种说法，即新核膜来自旧核膜。将变形虫培养在含有3H—胆碱的培养基中，33

H—胆碱掺人到膜脂的磷脂酰胆碱中，这样核膜便被H标记。将带有放射性标记的核取出，移植到正常的去核变形虫中，追踪观察一个细胞周期，结果发现子代细胞形成后，原有的放射性标记全部平均分配到子细胞的核被膜中，说明旧核膜参与了新核膜的构建。

对于核膜装配的机制及其与核孔复合体、核纤层的关系，目前尚无定论。一种以非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵提取物为基础的非细胞核装配体系(cell-free nuclear assembly system)为研究该问题提供了很好的实验模型。非洲爪蟾的卵母细胞成熟后处于第二次减数中期，此时的卵母细胞体积很大，直径可达 1mm，其中储存了大量的营养物质，为受精后快速卵裂做准备，一个成熟的卵母细胞所储备的原料可供形成103—104个细胞核。现已设法将这种卵提取物在体外(in vitro)成功地模拟出细胞核的构建及解体过程。目前越来越多的证据表明，一种直径200 nm左右的单层小膜泡直接参与了核膜的形成。它们首先附着到染色质表面，在染色质表面排列并相互融合形成双层膜，同时在膜上的某些部位内、外膜相互融合并形成核孔复合体结构。对HeLa细胞的有丝过程进行研究发现，核被膜在细胞周期中发生有序的去装配与重装配。从处于期的HeLa细胞中可以分离出两种膜泡组分：一组富含LBR，另一组富含 gp210。这说明核被膜的去装配不是随机的，而是具有区域特异性(domain- specific)。在有丝后期核被膜重新装配时，富含LBR的膜泡首先与染色质结合，而富含gp210的膜泡与染色质结合较晚。此外，核被膜的去装配、重装配变化受细胞周期因子的调节，这种调节作用可能通过对核纤层蛋白、核孔复合体蛋白等进行磷酸化与去磷酸化修饰来实现。

二、核孔复合体

1949—1950年间，H．G．Callan与S．G．Tomlin在用透射电子显微镜观察两栖类卵母细胞的核被膜时发现了核孔，随后人们逐渐认识到核孔并不是一个简单的孔洞，而是一个相对的复杂结构。1959年M．L．Watson将这种结构命名为核孔复合体(nuclear pore complex，NPC)。迄今已知所有的真核细胞，从酵 母到人，其间期细胞核普遍存在核孔复合体。核孔复合体在核被膜上的数量、分布密度与分布形式随细胞类型、细胞核的功能状态而有很大的差异。一般来说，转录功能活跃的细胞，其核孔复合体数量较多。一个典型的哺乳动物细胞核被膜上的核孔复合体总数约3 000～4 000个，相当于10～60个/m2。

(一)结构模型 精品文档

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核孔复合体镶嵌在内外核膜融合形成的核孔上，核孔的直径约为80～120 nm，而核孔复合体稍大一些，直径为120～150 nm，因为它有一部分结构嵌入核被膜内。有关核孔复合体的结构一直是一个令人感兴趣的问题，自被发现以来，不断有新的结构模型提出，但至今并不完善，仍有一些关键性的问题有待阐明。这主要是因为分离纯化核孔复合体的方法还不够完善，并且还受到电镜制样技术与观察方法的。研究核孔复合体形态结构的经典方法主要有三种：树脂包埋超薄切片技术、负染色技术与冷冻蚀刻技术(图8—2)。20世纪80年代以来，计算机图像处理技术应用于电镜的图像分析，高分辨率场发射扫描电镜技术 (HR—FESEM)的发展，以及快速冷冻—冷冻干燥制样技术的发展，使人们对核孔复合体的形态结构有了更深入的了解。综合已有的资料人们提出了一个最新的核孔复合体结构模型(图8—3)。细胞核用电镜超薄切片技术(A)和冷冻蚀刻技术 (B)显示的核孔复合体(NPC) 图8—3 核孔复合体结构模型(引自B．Alberts)

对于这个模型的结构组成目前有两种理解：①从横向上看，核孔复合体由周边向核孔中心依次可分为环、辐、栓三种结构亚单位；②从纵向上看，核孔复合体由核外(胞质面)向核内(核质面)依次可分为胞质环、辐(十栓)、核质环三种结构亚单位，形成“三明治”(sandwich)式的结构。综合起来，核孔复合体主要有以下4种结构组分：④胞质环(cytoplasmic ring)：位于核孔边缘的胞质面一侧，又称外环，环上有短纤维对称分布伸向胞质；⑤核质环(nuclear ring)：位于核孔边缘的核质面一侧，又称内环，内环比外环结构复杂，环上也对称地连有细长的纤维，向核内伸人50～70 nm，在纤维的末端形成一个直径为60 nm的小环，小环由8个颗粒构成。这样整个核质环就像一个“捕鱼笼”(fish-trap)样的结构，也有人称为核篮(nuclear basket)结构；⑥辐(spoke)：由核孔边缘伸向中心，呈辐射状八重对称。它的结构也比较复杂，可进一步分为三个结构域：主要的区域位于核孔边缘，连接内、外环，起支撑作用，称作“柱状亚单位”(column subunit)。在这个结构域之外，接触核膜部分的区域称为“腔内亚单位”(1uminal subunit)，它穿过核膜伸人双层核膜的膜间腔。在“柱状亚单位”之内，靠近核孔 复合体中心的部分称作“环带亚单位”(annularsubunit)，由8个颗粒状结构环绕形成核孔复合体核质交换的通道；③栓：或称栓(centralplug)，位于核孑L的中心，呈颗粒状或棒状，所以又称为颗粒(centralgranule)；由于推测它在核质交换中起一定的作用，所以还把它叫做“transporter”。不过不是在所有的核孔复合体中都能观察到这种结构，因此有人认为它不是核孔复合体的结构组分，而只是正在通过核孔 复合体的被转运的物质。由上述结构模型可见，核孔复合体对于垂直于核膜通过核孔 中心的轴呈辐射状八重对称结构，而相对于平行于核膜的平面则是不对称的，即核孔复合体在核质面与胞质面两侧的结构明显不对称，这与其在功能上的不对称性是一致的。

最近，对于\"fish-trap”结构又有新的发现。H．Ris与M．Malecki运用高分辨率场发射扫描电镜(HR—FESEM)观察非洲爪蟾卵母细胞核膜上的核孔复合体，发现\"fish-trap\"并非中断并游离在核质中，而是与一种称为“cable”的网络通道相连通。这种cable由与“fish-trap”类似的结构单位串联而成，看上去像是“fish-trap”上的纤维与小环在核质中的周期性重复与延续。从\"fish-trap”末端小环的8个颗粒上又发出细长的纤维，在纤维上周期性地间隔有8个颗粒构 成的环状结构。不同的“fish—trap\"发出的cable相互交叉，使精品文档

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cable成为一个遍布核质、相互贯通的复杂的网络。这种与“fish—trap\"相连、相似的cable有何功能尚不清楚，推测它很可能与核孔复合体的核质转运功能有关。

(二)核孔复合体成分的研究

核孔复合体主要由蛋白质构成，其总相对分子质量约为125 000X103’，推测可能含有100余种不同的多肽，共1 000多个蛋白质分子。最近两年，分离鉴定核孔复合体蛋白成分的工作进展很快，特别是生化与遗传学技术相结合，在酵母中已鉴定出30余种与核孔复合体相关的蛋白成分。迄今已鉴定的脊椎动物的核孔复合体蛋白成分也已达到十多种(表8—1)，其中gp210与p62是最具有代表性的两个成分，它们分别代表着核孔复合体蛋白的两种类型。实际上，这两类蛋白成分在从酵母到人的多种生物中都已被发现证实，它们在不同的物种中有很强的同源性；核孔复合体的整个结构在进化上是高度保守的。目前人们倾向于把所有的核孔复合体蛋白统一命名为“核孔蛋白”(nucleoporin，Nup)。

表8—1 已知的脊椎动物核孔复合体的蛋白成分简表蛋白名称 gp210代表一类结构性跨膜蛋白，是第一个被鉴定出来的核孔复合体蛋白，相对分子质量为210X103，位于核膜的“孔膜区”，故认为它在锚定核孔复合体的结构上起重要作用。其糖基化修饰位点在天冬酰胺残基上，为N连接甘露糖残基寡糖链，因而与刀豆球蛋白A(ConA)有较强的结合作用。它在糙面内质网上新合成时，N端带有信号肽，但并不参与核孔复合体结构的形成。目前认为 gp210主要有三方面的功能：①介导核孔复合体与核被膜的连接，将核孔复合体锚定在“孔膜区”，从而为核孔复合体装配提供一个起始位点；②在内、外核膜融合形成核孔中起重要作用。gp210氨基酸序列中有两段疏水区，其中靠近C端的疏水区位于孔膜区，是跨膜结构域，另一段疏水区则位于核周间隙内，推测当核孔复合体装配开始时，gp210位于核周间隙内的肽段构象发生变化，从而使其中的疏水区暴露，使之与核膜相互作用，通过这一方式诱导内外核膜融合；③在核孔复合体的核质交换功能活动中起一定作用，如gp210核周间隙内肽段的抗体能够降低蛋白质人核转运的速度。后来又报道发现另外一种位于孔 膜区的蛋白成分，命名为Poml21。

p62代表一类功能性的核孔复合体蛋白。它带有O连接N—乙酰葡萄糖胺残基(O-linked GlcNac)寡糖修饰，因此与麦胚凝集素(WGA)有较强的亲和性。脊椎动物的p62分子主要分为两个结构域：①疏水性N端区，具有XFXFX (F：苯丙氨酸；x：任意氨基酸)形式的重复序列，由其氨基酸序列推测适合形成—折叠结构；糖基化修饰发生在这个区域中接近C端区的肽段。这个区域可能在核孔复合体功能活动中直接参与核质交换。②C端区，具有疏水性的七肽重复序列，类似一些纤维蛋白(如中间纤维蛋白、核纤层蛋白)的杆状区，适合形成—螺旋。推测这个区域可能通过卷曲螺旋与其他核孔复合体蛋白成分相互作用，从而将p62分子稳定到核孔复合体上，为其N端进行核质交换活动提供支持。p62对核孔复合体行使正常的功能非常重要。目前，这一类核孔复合体蛋白成分已有很多被鉴定出来，其中有些像p62一样带有O连接GlcNac类型的糖基化修饰，并且含有一些重复序列，如Nupl53中的FXFG(F：苯丙氨酸，X：任意氨基酸，G：甘氨酸)，Nup98中的GLFG(L：亮氨酸)，也有些没有任何糖基化修饰或类似的重复序列。

(三)核孔复合体的功能：核质交换的双向选择性亲水通道 精品文档

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从功能上讲，核孔复合体可以看作是一种特殊的跨膜运输蛋白复合体，并且是一个双功能、双向性的亲水性核质交换通道。双功能表现在它有两种运输方式：被动扩散与主动运输。双向性表现在既介导蛋白质的人核转运，又介导 RNA、核糖核蛋白颗粒(RNP)的出核转运(图8—4)。 1．通过核孔 复合体的被动扩散 核孔复合体作为被动扩散的亲水通道，其有效直径为9～10 nm，有的可达 12．5nm，即离子、小分子以及直径在10 nm以下的物质原则上可以自由通过。对静止期核孔的有效大小是通过将标记的非核组成成分注射到细胞质中，计算它们向核内扩散的速率来研究的。将聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone， PVP)包被的胶体金颗粒，通过显微注射引入变形虫细胞质内，然后在电镜下检查金颗粒的分布，结果发现它们是经过核孔复合体的中心进入细胞核的，估计通道的直径为12．5 nm。通过核孔复合体的扩散速度与分子大小成反比，相对分子质量小于5．0X103的小分子可以自由扩散，17X103的蛋白质在2 min内可达到核质间平衡，44X103的蛋白质需30min达到平衡，而大于60X103的 球蛋白则几乎不能进入核内。根据这些定量分析资料推断，核孔复合体是一个圆形亲水通道，其功能直径为9 nm，长约15 nm的通道。这与电镜照片上可以看到的通道的大小是基本一致的。对于球形蛋白质，这种有效直径相当于允许相对分子质量在40X10’3一60X10’3以下的蛋白质分子自由穿过核孔。但实际上并不是所有符合这个条件的蛋白质都可以随意出入细胞核。有许多小分子的蛋白质，如组蛋白Hl，其相对分子质量虽只有21X103’，但由于它本身带有具信号功能的氨基酸序列，所以是通过主动运输进入细胞核的；有的小分子蛋白质本 身虽然没有信号序列，但可以与其他有信号序列的成分结合，一起被主动运输到核内。因此，核孔复合体的这种被动扩散通道并不意味着所有10 nm以下的小分子在核被膜两侧就一定均匀分布。有些小分子蛋白质可能会因为与其他大分子相结合，或与一些不溶性结构成分(如中间纤维、核骨架等)结合而被在细胞质或细胞核内。④④④④

b 爪蟾卵母细胞核质蛋白注射实验(引自B．Alberts) 2．通过核孔 复合体的主动运输

生物大分子的核质分配如亲核蛋白的核输入，RNA分子及RNP颗粒的核输出，在细胞核功能活性的控制中起着非常重要的作用。对于真核细胞来说，典型的哺乳类细胞的核被膜上有3 000～4 000个核孔(约11个～m2)，如果细胞正在合成DNA，为了确保染色质包装，则需要每3min从细胞质向核内输入106个组蛋白分子，这意味着每个核孔每分钟要运进100个组蛋白分子。如果细胞在迅速生长，则需要每个核孔每分钟从细胞核向细胞质输出三对核糖体大小亚基，以确保蛋白质合成的需要。现在已知，这种大分子的核质分配主要是通过核孔复合体的主动运输完成的，具有高度的选择性，并且是双向的。其主动运输的选择性表现在以下三个方面：①对运输颗粒大小的。主动运输的功能直径比被动运输大，约10—20 nm，甚至可达26 nm。像核糖体亚单位那样大的RNP颗粒也可以通过核孑L复合体从核内运输到细胞质中，表明核孔复合体的有效直径的大小是可被调节的；②通过核孑L复合体的主动运输是一个信号识别与载体介导的过程，需要消耗ATP能量，并表现出饱和动力学特征；③通过核孔复合体的主动运输具有双向性，即核输入与核输出，它既能把复制、转录、染色体构建和核糖体亚单位装配等所需要的各种因子如DNA聚合酶、RNA聚合酶、组蛋白、核糖体蛋白等运输到核内；同时又能将翻译所需的RNA、装精品文档

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配好的核糖体亚 单位从核内运送到细胞质。有些蛋白质或RNA分子甚至两次或多次穿越核孔复合体，如核糖体蛋白、snRNA等。 近几年对于亲核蛋白的人核转运机制的研究进展较快。亲核蛋白 (karyophilic protein)是指在细胞质内合成后，需要或能够进入细胞核内发挥功能的一类蛋白质。大多数的亲核蛋白往往在一个细胞周期中一次性地被转运到核内，并一直停留在核内行使功能活动，典型的如组蛋白、核纤层蛋白等；但也有一些亲核蛋白需要穿梭于核质之间进行功能活动，如importins。通过研究核质蛋白(nucleoplasmin)的入核转运，人们逐步发现了指导亲核蛋白人核的信号。核质蛋白，相对分子质量165X103，是一个五聚体，在非洲爪蟾卵母细胞核中含量丰富。用蛋白水解酶进行有限的水解，可以分别得到头部片段(N端)与尾部片段(C端)。将带有放射性标记的完整核质蛋白或头、尾片段分别注射到爪蟾卵母细胞的细胞质中，结果发现，完整的核质蛋白能够在细胞核内迅速地积累，同时发现尾部片段也能被高效地转运到核内，而头部片段却被拒之核外(图8— 5)。显然有某种亲核的输入信号存在于尾部片段。如果把尾部片段包裹在直径 20 nm的胶体金颗粒上，然后注射到细胞质中，这种金颗粒也能在核内积累；换用完整的核质蛋白包裹胶体金颗粒可以得到同样的结果。现在已经证实，亲核蛋白一般都含有特殊的氨基酸序列，这些内含的特殊短肽保证了整个蛋白质能够通过核孔复合体被转运到细胞核内。这段具有“定向”、“定位”作用的序列被命名为核定位序列或核定位信号(nuclear localization sequence或nuclear localization signal，NLS)。第一个被确定序列的NLS来自猴肾病毒(SV40)的T抗原 (相对分子质量92X103)。这个NLS由7个氨基酸残基构成：Pro—Lys—Lys— Lys—Arg—Lys—Val。其中仅一个氨基酸残基突变就会导致该蛋白在胞质内不正常积累；如果将这段NLS序列连接到非亲核蛋白上，则非亲核蛋白就会被转运到核内。此后，又陆续鉴定出一些其他亲核蛋白的NLS。目前认为NLS是存在于亲核蛋白内的一些短的氨基酸序列片段，富含碱性氨基酸残基，如Lys、 Arg，此外还常常含有Pro。这些氨基酸残基片段可以是一段连续的序列，如上述SV40T抗原的NLS，也有分成两段存在于亲核蛋白的氨基酸序列中，两段之间往往间隔约10个氨基酸残基，如核质蛋白的NLS。在不同的NLS之间尚未发现共有的特征序列。与指导蛋白质跨膜运输的信号肽不同，NLS序列可存在于亲核蛋白的不同部位，并且在指导亲核蛋白完成核输入后并不被切除。

亲核蛋白通过核孔复合体的转运是分步进行的，根据整个过程对能量的需求可粗略的分为两步：结合(binding)与转移(translocation)。亲核蛋白首先结合到核孔复合体的胞质面，这一步不需要能量，但依赖正常的NLS；随后的转移步骤则需要GTP水解供能。亲核蛋白除了本身具有NLS外，其人核转运还需要一些胞质蛋白因子的帮助。目前比较确定的因子有importina、importin卢、Ran (一种GTP结合蛋白)和NTF2等。在它们的参与下，亲核蛋白的人核转运可分为如下几个步骤(图8—6)：①亲核蛋白通过NLS识别importina，与可溶性 NLS受体importin。／improtin异二聚体结合，形成转运复合物；②在importin 的介导下，转运复合物与核孔复合体的胞质纤维结合；③转运复合物通过改变构象的核孔复合体从胞质面被转移到核质面；④转运复合物在核质面与Ran— GTP结合，并导致复合物解离，亲核蛋白释放；⑤受体的亚基与结合的Ran返回胞质，在胞质内Ran—GTP水解形成Ran—GDP并与importin解离，Ran— GDP返回核内再转换成Ran—GTP状态， 精品文档

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亲核蛋白从细胞质向细胞核输入的过程示意图

应该指出，NLS只是亲核蛋白人核的一个必要条件，某种亲核蛋白是否被转运人核还受到其他因素的影响。已经发现有很多带有NLS的蛋白质由于种种原因滞留在胞质内。它们有的是因为其NLS的活性被封闭(masking)，如磷酸化修饰；有的是由于与“胞质滞留因子”(cytoplasmic retention factor)的结合，如与细胞骨架的结合导致亲核蛋白不能自由活动。总之，蛋白质人核转运作为一种重要的核质物质交换与信息交流活动，是受到多种因素综合调节的。 对于RNA及核糖体亚单位的出核转运机制了解得较少。真核细胞中RNA一般要经过转录后加工、修饰成为成熟的RNA分子后才能被转运出核。①由 RNA聚合酶I转录的rRNA分子，总是在核仁中与从胞质中转运进来的核糖体蛋白结合形成核糖体亚单位，以核糖核蛋白颗粒(RNP)的形式离开细胞核，转运过程需要能量；②由RNA聚合酶Ⅲ转录的5S rRNA与tRNA的转运是一种由蛋白质介导的过程；③由RNA聚合酶Ⅱ转录的核内不均一RNA(heterogeneous nuclearRNA，hnRNA)，首先需要在核内进行5，端加帽和3，端附加多聚A序列以及剪接等加工过程，然后形成成熟的mRNA出核。出核转运也是一个需要载体的主动运输过程。最近的研究表明，在细胞核中既有正信号保证mRNA的出核转运，也有负信号防止mRNA的前体被错误地运输。由DNA转录出来的mRNA前体只有在核内经过转录后加工、修饰成为成熟的RNA分子后才能被转运出核。目前认为5’端的m7GpppG\"帽子”结构对mRNA的出核转运 是必要的。防止mRNA的错误出核与剪接体(spliceosome)有关，实验证明在剪接体形成与mRNA出核转运之间存在竞争。mRNA的出核转运过程是有极性的，其5，端首先通过核孔复合体，3，端最后离开细胞核。此外，RNA分子的出核转运需要蛋白分子的帮助。真核细胞的snRNA、mRNA与tRNA，无论在细胞质还是在细胞核中，都是与相关的蛋白质结合在一起，即以各种RNP颗粒的形式存在的。所谓RNA的出核转运实际上是RNA—蛋白质复合体的转运，即 RNA的核输出离不开特殊的蛋白因子的参与，这些蛋白因子本身含有出核信号。目前人们正致力于寻找在RNA分子与核孔复合体之间起桥梁作用的信号与载体。已发现一些与RNA共同出核的蛋白因子，如HIV病毒的Rev蛋白，转录因子TFⅢA，蛋白激酶A抑制因子PKI等，含有对它们的出核转运起决定作用的氨基酸序列，命名为核输出信号

(nuclearexportsignal，NES)。此外，有迹象表明人核转运与出核转运之间有某种联系，如它们可能需要某些共同的因子。

第二节 染色 质

1879年，W．Flemming提出了染色质(chromatin)这一术语，用以描述细胞核中能被碱性染料强烈着色的物质。1888年，Waldeyer正式提出染色体的命名。经过一个多世纪的研究，人们对这种遗传物质的载体有了比较深入的认识。染色质和染色体是在细胞周期不同阶段可以互相转变的形态结构。下面将间期染色质和中期染色体分成两节叙述，完全是为了考虑章节内容的平衡及教学的方便。

一、染色质的概念及化学组成

染色质是指间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的线性复合结构，是间期细胞遗传物质存在的形式。染色体是指细胞在有丝或减数过程中，由染色质聚缩而成的棒状结构。实际上，两者之间的区别主要并不在于化学组成上的差异，而在于包装程度不同，反映了它们处于细胞周

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期中不同的功能阶段。在真核细胞的细胞周期中，大部分时间是以染色质的形态而存在的。

通过分离胸腺、肝或其他细胞的核，用去垢剂处理后再离心收集染色质进行生化分析，确定染色质的主要成分是DNA和组蛋白，还有非组蛋白及少量 RNA。大鼠肝细胞染色质常被当作染色质成分分析模型，其中组蛋白与DNA含量之比近于1：1，非组蛋白与DNA之比是0．6：1，RNA／DNA比率为0．1：1。 DNA与组蛋白是染色质的稳定成分，非组蛋白与RNA的含量则随细胞生理状态不同而变化。

(一)染色质DNA

凡是具有细胞形态的所有生物其遗传物质都是DNA。只有少数病毒遗传物质是RNA。在真核细胞中，每条未复制的染色体包装一条DNA分子。一个生物储存在单倍染色体组中的总遗传信息，称为该生物的基因组(genome)。真核生物每个细胞中基因组DNA含量比原核生物高得多。大肠杆菌(E．coli)的基因组含4．2X106bp，平均基因长1．2kb，基因数目约2 350；而真核生物酵母 (S．cerevisiae)基因组3～4倍于大肠杆菌的DNA，为1．3X107’bp，平均基因长 1．4kb，约有6 100个基因；果蝇(D．melanogaster)高达40倍

(1．4X108“bp)，平均基因长11．3kb，约有8 750个基因；人的单倍体基因组几乎高达800倍，为 3X109bp，平均基因长16．3kb，约有125 000个基因。然而，根据突变分析表明，并非所有基因都是必需基因(essential gene)，酵母基因组有40％的基因属于非必需基因(nonessential gene)，果蝇基因组只有5 000个必需基因。至于如此多的非必需基因如何保存下来尚不清楚，推测它们有可能在生物进化上提供某种选择优势。生物基因组中的遗传信息大体可分两类：一类是负责蛋白质氨基酸组成的信息，以三联体密码(triplet)方式进行编码，巧妙地解决了在有限的小空间储存大量遗传信息的矛盾。细胞中编码DNA序列在基因组中只占很小的比例，在高等哺乳类，这一比例大约只有5％左右。这类编码序列主要是非重复的单一DNA序列，一般在基因组中只有一个或几个拷贝；另外一类是中度重复序列DNA，它们是关于基因选择性表达的信息，这种选择性表现在：不同的物种、个体发育的不同阶段和不同的组织以及不同的细胞类型中，各种基因是关闭还是表达，表达的强度如何，都是各不相同的。这类起作用的DNA序列在整个基因组中占有很高的比例，并且能与蛋白相互作用而修饰自己的双螺旋空间结构，以便更好地为蛋白所识别。有些中度重复序列DNA具有编码功能，如编码rRNA和tRNA以及组蛋白的基因，但大部分中度重复序列不编码任何产物，这类重复序列又可分为两类：一类称短散在重复元件(short interspersedelements，SINEs)，典型SINEs其长度少于500 bp，如人和灵长类基因组中大量分散存在的Alu家族，人基因组中约有50万到70万份Alu拷贝，相当平均每隔4kb就有一个Alu序列；另一类称长散在重复元件(long interspersed elements，LINEs)，典型LINEs其长度多于1 000 bp，如人基因组中L1家族，有 100 000个L1拷贝。这两类缺少编码功能的中度重复序列DNA是物种进化过程中在基因组中可移动的遗传元件，并且影响基因表达。此外，真核细胞基因组中，还含有高度重复DNA序列，每个基因组中至少含105拷贝，约占脊椎动物总 DNA的10％。高度重复DNA序列由一些短的DNA序列呈串联重复排列，可进一步分为几种不同类型：卫星DNA(satelliteDNA)，重复单位长5～100 bp，不同物种重复单位碱基组成不同，一个物种也可能含有不同的卫星DNA序列。主要分布在染色体着丝粒部精品文档

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位，如人类染色体着丝粒区的。卫星DNA家族，其功能不明。小卫星

DNA(minisatelliteDNA)重复单位长12～100 bp，重复3 000次之多，又称数量可变的串联重复序列，每个小卫星区重复序列的拷贝数是高度可变的，因此常用DNA指纹技术(DNA finger-printing)作个体鉴定；另外发现小卫星序列的改变可以影响邻近基因的表达，基因的异常表达又导致一系列不良 后效应。微卫星DNA(microsatelliteDNA)重复单位序列最短，只有1～5bp，串联成簇长度50～100bp的微卫星序列。人类基因组中至少有30 000个不同的微卫星位点，具高度微卫星多态性(microsatellite plymorphism)，不同个体间有明显差别，但在遗传上却是高度保守的，因此可作为重要的遗传标志，用于构建遗传图谱(genetic map)。

生物的遗传信息储存在DNA的核苷酸序列中，生物界物种的多样性也寓于DNA分子4种核苷酸千变万化的不同排列之中。DNA分子不仅一级结构具有多样性，而且二级结构也具有多形性(po1ymorphism)。所谓二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。DNA二级结构构型分三种： B型DNA(右手双螺旋DNA)是“经典”的Watson-Crick结构，二级结构相对稳定，水溶液和细胞内天然DNA大多为B型DNA；A型DNA是一般B型DNA的重要变构形式，同样是右手双螺旋DNA，其分子形状与RNA的双链区和 DNA／RNA杂交分子很相近。第三种是Z型DNA，Z型DNA是左手螺旋，也是 B型DNA的变构形式。三种构型DNA的主要特征见表8—2。

三种构型DNA中，特别是大沟的特征在遗传信息表达过程中起关键作用。基因表达蛋白都是通过其分子上特定的氨基酸侧链与沟中碱基对两侧潜在的氢原子供体(=NH)或受体(O和N)形成氢键而识别DNA遗传信息的。由于大沟和小沟中这些氢原子供体和受体各异以及排列不同，所以大沟携带的信息要比小沟多。此外，沟的宽窄及深浅也直接影响碱基对的暴露程度，从而影响蛋白对DNA信息的识别。B型DNA是活性最高的DNA构象；变构后的A型DNA仍有活性；变构后的Z型DNA活性明显降低。人们推测，在生理状态下，由于细胞内各种化学修饰的影响和结合蛋白的作用有可能使三种构型的 DNA处于一种动态转变之中。此外DNA双螺旋能进一步扭曲盘绕形成特定的高级结构，正、负超螺旋是DNA高级结构的主要形式。DNA二级结构的变化与高级结构的变化是相互关联的，这种变化在DNA复制与转录中具有重要的生物学意义。 (二)染色质蛋白 染色质DNA结合蛋白负责DNA分子遗传信息的组织、复制和阅读。这些 DNA结合蛋白包括两类：一是组蛋白(histone)，与DNA非特异性结合；另一类是非组蛋白(nonhistone)，与DNA特异性相结合。 1．组蛋白 组蛋白是构成真核生物染色体的基本结构蛋白，富含带正电荷的Arg和 Lys等碱性氨基酸，等电点一般在pHl0．0以上，属碱性蛋白质；可以和酸性的 DNA紧密结合，而且一般不要求特殊的核苷酸序列，用聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将组蛋白区分为5种组分：H1、H2A、H2B、H3和H4。几乎所有真核细胞都含有这5种组蛋白，而且含量丰富，每个细胞每种类型的组蛋白约6“x107’个分十。表8—3列举了5种组蛋白的一些特征。

5种组蛋白在功能上分为两组：①核小体组蛋白(nucleosomal histone)，包括H2B、H2A、H3和H4，这4种组蛋白有相互作用形成聚合体的趋势，它们通过 C端的疏水氨基酸(如Val，11e)互相结合，而N端带正电荷的氨基酸(Arg、精品文档

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Lys)则向四面伸出以便与DNA分子结合，从而帮助DNA卷曲形成核小体的稳定结构。这4种组蛋白没有种属及组织特异性，在进化上十分保守，特别是H3和 H4是所有已知蛋白质中最为保守的。例如牛和豌豆的H4组蛋白的102个氨基酸残基中仅有2个不同，而它们的分歧时间已有3亿年的历史。这种保守性表明，H3和H4的功能几乎涉及它们所有的氨基酸，以致任何位置上氨基酸残基的突变对细胞都将是有害的。②H1组蛋白，其分子较大(215个氨基酸)，球形中心在进化上保守，而N端和C端两个“臂”的氨基酸变异较大，所以HI在进化上不如核小体组蛋白那么保守。在构成核小体时H1起连接作用，它赋予染色质以极性。H1有一定的种属和组织特异性，在哺乳类细胞中，组蛋白HI约有6种密切相关的亚型，氨基酸顺序稍有不同。在成熟的鱼类和鸟类红细胞中， H1为H5取代，有的生物如酵母(Saccharomycescerevzsae)缺少H1，结果酵母细胞差不多所有染色质都表现为活化状态* 2．非组蛋白

与染色体组蛋白不同，非组蛋白(nonhistone)主要是指染色体上与特异 DNA序列相结合的蛋白质，所以又称序列特异性DNA结合蛋白(sequence‘ spe cific DNA binding proteins)。利用非组蛋白与特异序列DNA亲合的特点，通过凝胶延滞实验(gel retardation assay)，可以在细胞抽提物中进行检测。首先制备一段带有放射性标记的已知特异序列的DNA。将要检测的细胞抽提物与标记 DNA混合，进行凝胶电泳。未结合蛋白的自由DNA在凝胶上迁移最快，而与蛋白质结合的DNA迁移慢，一般结合的蛋白质分子越大，DNA分子的延滞现象越明显，然后通过放射性自显影分析，即可发现一系列DNA带谱，每条带分别代表不同的DNA—蛋白质复合物。每条带相对应的结合蛋白随后再通过细胞抽提物组分分离方法被进一步分开。 (1)非组蛋白的特性

①非组蛋白具多样性和异质性

非组蛋白占染色体蛋白的60％～70％，不同组织细胞中其种类和数量都不相同，代谢周转快。包括多种参与核酸代谢与修饰的酶类如DNA和RNA聚合酶、HMG蛋白(high mobility group proteins，)、核质蛋白、染色体骨架蛋白、肌动蛋白和基因表达蛋白等。 ②对DNA具有识别特异性

能识别特异的DNA序列，识别信息来源于DNA核苷酸序列本身，识别位点存在于DNA双螺旋的大沟部分。识别与结合靠氢键和离子键。在不同的基因组之间，这些非组蛋白所识别的DNA序列在进化上是保守的。这类序列特异性DNA结合蛋白具有一个共同特征，即形成与DNA结合的螺旋区并具有蛋白二聚化的能力。

③具有多种功能

虽然与DNA特异序列结合的蛋白质在每个真核细胞中只有10 000个分子左右，约占细胞总蛋白的1／5万，但却具有多方面的重要功能，包括基因表达的和染色质高级结构的形成。如帮助DNA分子折叠，以形成不同的结构域，协助启动DNA复制，控制基因转录，调节基因表达。 (2)序列特异性DNA结合蛋白的不同结构模式

根据迄今发现的众多的DNA特异性结合蛋白的分析，发现它们可分为不同的结合蛋白家族，与DNA结合的结构域，分别具有以下不同的结构模式： ①螺旋—转角—螺旋模式(helix-turn-helix motif) 精品文档

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这是最早在原核基因的激活蛋白和阻抑物(repressor)中发现的。迄今已在百种以上原核细胞和真核生物中发现这种最简单、最普遍的DNA结合蛋白的结构模式。这种蛋白与DNA结合时，形成对称的同型二聚体(symmetric

homodimer)结构模式(图8—7A)。构成同型二聚体的每个单体由20个氨基酸的小肽组成螺旋—转角—螺旋结构，两个螺旋相互连接构成转角，其中羧基端的螺旋为识别螺旋(recognitionhelix)，负责识别DNA大沟的特异碱基信息，另一个螺旋没有碱基特异性，与DNA磷酸戊糖链骨架接触。在与DNA特异结合时，以二聚体形式发挥作用，结合靠蛋白质的氨基酸侧链与特异碱基对之间形成氢键。

②锌指模式(Zinc finger motif)

负责5S RNA、tRNA和部分snRNA基因转录的RNA聚合酶Ⅲ所必需的

转录因子TFⅢA是首先被发现的锌指蛋白，由344个氨基酸组成(相对分子质 量40X103)。TFⅢA含9个有规律的锌指重复单位，每个单位30个氨基酸残 基，其中一对半胱氨酸和一对组氨酸与Zn2’形成配位键，每个锌指单位是一个 DNA结合结构域(DNA—banding domain)，每个锌指的C端形成螺旋负责与 DNA结合。这类Cys2／His2锌指单位的共有序列(consensus sequence)是：Cys— X2~4—Cys—X3—Phe—X5—Leu—X2—His—X3—His。哺乳类转录因子SPl也有类似的锌指结构，由三个锌指单位组成。另一类锌指蛋白含两对半胱氨酸，而不含组氨酸，如哺乳类细胞的甾体类激素受体蛋白(图8—7B，C)，这类Cys2／ Cys2锌指单位的结合Zn2’的共有序列是：Cys—X2—Cys—X13—Cys—X2—Cys。

③亮氨酸拉链模式(Leucine zipper motif，ZIP)

在构建转录复合物(transcription complex)过程中，普遍涉及蛋白与蛋白之间的相互作用，形成二聚体是识别特异DNA序列蛋白的相互作用的共同原则亮氨酸拉链就是富含Leu残基的一段氨基酸序列所组成的二聚化结构。这类序列特异性DNA结合蛋白家族，包括酵母的转录激活因子(GCN4)，癌蛋白Jun、 Fos、Myc以及增强子结合蛋白(enhancer binding proteins，C／EBP)等。所有这些蛋白的肽链羧基端约35个氨基酸残基有形成螺旋的特点，每两圈(7个氨基酸残基)有一个亮氨酸残基。这样，在螺旋一侧的Leu排成一排，两个蛋白质分子的。螺旋之间靠Leu残基之间的疏水作用力形成一条拉链状结构(图8— 7D)。这类蛋白与DNA的特异结合都是以二聚体形式起作用的，但与DNA结合的结构域是拉链区相邻的肽链N端带正电荷的氨基酸碱性区。 ④螺旋—环—螺旋结构模式(helix-loop-helix motif，HLH)

HLH这一结构模式广泛存在于动植物DNA结合蛋白中。HLH由40～50个氨基酸组成两个两性。螺旋，两个。螺旋中间被一个或几个9转角组成的环区所分开。每个螺旋由15～16个氨基酸残基组成，并含有几个保守的氨基酸残基。具有疏水面和亲水面的两性。螺旋有助于二聚体的形成。螺旋邻近的肽链N端也有带正电荷的氨基酸碱性区与靶DNA大沟结合(图8—7E)。具有螺旋—环—螺旋结构的蛋白家族成员之间形成同源或异源二聚体是这类蛋白与DNA结合的必要条件，缺失螺旋的二聚体不能牢固结合DNA。具有这类结构模式的转录因子如哺乳类的MyoD、昆虫的AC—S等。 ⑤HMG框结构模式(HMG-boxmotif)

在发现一组丰富的高速泳动族蛋白(high mobility group proteins)以后，首先发现并命名HMG框结构模式。该结构有三个。螺旋组成boomerang-精品文档

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shaped结构模式，具有弯曲DNA的能力。因此，具有HMG框结构的转录因子又称“构件因子”(architecturalfactors)，它们通过弯曲DNA、促进与邻近位点相结合的其他转录因子的相互作用而激活转录。SRY是一种HMG蛋白，在人类男性性别分化中具有关键作用，HMG蛋白由Y染色体上一个基因编码，在诱导睾丸分化途径中一些相关基因的转录活性被HMG蛋白所激活。突变的SRY基因所编码的蛋白不能与DNA结合，导致产生性逆转，具有这种表型的个体虽然具有 XY性染色体对，但却发育成雌性。另一种HMG蛋白是UBF，能激活RNA聚合酶I对rRNA基因的转录，UBF以二聚体形式结合DNA，两个亚基含有总共 10个HMG框，UBF通过与DNA相互作用，使DNA围绕蛋白质形成环化结构，

通常情况下，这段DNA所具有的两个序列被120 bpDNA所分开，环化后使之靠近，与一个或多个转录因子结合(图8—7F)。

二染色质的基本结构单位

20世纪70年代以前，人们关于染色质结构的传统看法认为，染色质是组蛋白包裹在DNA外面形成的纤维状结构。1974年Kornberg等人根据染色质的酶切降解和电镜观察，发现核小体(nucleosome)是染色质包装的基本结构单位，提出染色质结构的“串珠”模型，从而更新了人们关于染色质结构的传统观念。 (一)主要实验证据

1．用温和的方法裂解细胞核，将染色质铺展在电镜铜网上，通过电镜观察，未经处理的染色质自然结构为30 am的纤丝，经盐溶液处理后解聚的染色质呈现一系列核小体彼此连接的串珠状结构，念珠的直径为10 nm(图8—8)。 图8—8 处理前后的染色质丝的电镜照片

2．用非特异性微球菌核酸酶(micrococcal nuclease)消化染色质时，经过蔗糖梯度离心及琼脂糖凝胶电泳分析，发现绝大多数DNA被降解成大约200 bp的片段；如果部分酶解，则得到的片段是以200bp为单位的单体、二体(400bp)、三体(600bp)等等。蔗糖梯度离心得到的不同组分，在波长260 am的吸收峰的大小和电镜下所见到的单体、二体和三体的核小体组成完全一致。如果用同样方法处理裸露的DNA，则产生随机大小的片段群体。从而提示染色体DNA除某些周期性位点之外均受到某种结构的保护，避免酶的接近。

3．应用X射线衍射、中子散射和电镜三维重建技术，研究染色质结晶颗粒，发现核小体颗粒是直径为11 nm、高6．0 nm的扁圆柱体，具有二分对称性(dyadsymmetry)，核心组蛋白的构成是先形成(H3)：·(H4)：四聚体，然后再与两个

H2A·H2B异二聚体结合形成八聚体(图8—9)。

图8—9 由X射线晶体衍射所揭示的核小体三维结构(引自K．Luger等，1997)

4．SV40微小染色体(minichromosome)分析。用SV40病毒感染细胞，病毒 DNA进入细胞后，与宿主的组蛋白结合，形成串珠状微小染色体，电镜观察到 SV40DNA为环状，周长1 500 nm，约5．0 kb。若200bp相当于一个核小体，则可形成25个核小体，实际观察到23个，与推断基本一致。如用0．25 mol／L盐酸将SV40溶解，可在电镜下直接看到组蛋白的聚合体，若除去组蛋白，则完全伸展的DNA长度恰好为5．0 kb。 (二)核小体结构要点

1．每个核小体单位包括200 bp左右的DNA超螺旋和1个组蛋白八聚体以及一个分子的组蛋白H1。 精品文档

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2．组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构，相对分子质量100X103，由 4个二聚体组成，包括两个H2A·H2B和两个H3·H4。两个H3·H4形成四聚体位于核心颗粒，两个H2A·H2B二聚体分别位于四聚体两侧。每个二聚体通过离子键和氢键结合约30bpDNA。

3．146 bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1．75圈。组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bpDNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。包括组蛋白H1和166bPDNA的核小体结构又称染色质小体(chromotosome)。

4．两个相邻核小体之间以连接DNA(1inkerDNA)相连，典型长度60bp，不同物种变化值为0—80 bp不等(图8—10)。

5．组蛋白与DNA之间的相互作用主要是结构性的，基本不依赖于核苷酸的特异序列。正常情况下不与组蛋白结合的DNA(如噬菌体DNA或人工合成

6．核小体沿DNA的定位受不同因素的影响。如非组蛋白与DNA特异性位点的结合，可影响邻近核小体的相位(positioning)；DNA盘绕组蛋白核心的弯曲也是核小体相位的影响因素，因为富含AT的DNA片段优先存在于DNA双螺旋的小沟，面向组蛋白八聚体，而富含GC的DNA片段优先存在于DNA双螺旋的大沟，背向组蛋白八聚体，结果核小体倾向于形成富含AT和富含GC区的理想分布，从而通过核小体相位改变影响基因表达。 三、染色质包装的结构模型

人的每个体细胞所含的DNA约6X109bp分布在46条染色体中，总长达 2m，平均每条染色体DNA分子长约5 cm，而细胞核的直径只有约5～8／lm，这就意味着从染色质DNA包装成染色体要压缩近万倍，相当于一个网球含有2 km长的细线。 (一)染色质包装的多级螺旋模型 由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形 成直径约10 nm的核小体串珠结构，这是染色质包装的一级结构。不过在生活的细胞中，染色质很少以这种伸展的串珠状形式存在。当细胞核经温和处理后，在电镜下往往会看到直径为30 nm的染色质纤维。由核小体串珠结构如何包装成30 nm的染色质纤维，其模型之一如图8—11所示。在有组蛋白H1存在的情况下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成外径30nm，内径10nm，螺距11 nm的螺线管(solenoid)。组蛋白H1在螺线管中的空间位置尚不清楚，但对螺线管的稳定起着重要作用。螺线管是染色质包装图8核小体串珠结构如何包装成30 nm直径的螺线管的图解(引自B．Alberts) ·A：30 nm染色质纤维电镜照片；S：多级螺旋模型

Bak等(1977)从人胎儿离体培养的细胞中分离出染色体，经温和处理后，在电镜下看到直径0．4 p．m，长11—60 btm的染色线，称为单位线(unit fiber)；在电镜下观察，判明单位线是由螺线管进一步螺旋化形成直径为0．4gm的圆筒状结构，称为超螺线管(supersolenoid)，这是染色体包装的三级结构。这种超螺线管进一步螺旋折叠，形成长2～10nm的染色单体(chromatid)，即染色质包装的四级结构。根据多级螺旋模型

(multiplecoilingmodel)，从DNA到染色体经过四级包装： 经过四级螺旋包装形成的染色体结构，共压缩了8 400倍。

(二)染色体的骨架—放射环结构模型(scaffold radial loop structure model) 精品文档

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关于染色质的包装，虽然在一级和二级结构上已基本取得一致的看法，但对直径30nm的螺线管如何进一步包装成染色体尚有不同意见。

Laemmli等人用2mol／L的NaCl或硫酸葡聚糖加肝素处理HeLa细胞中期染色体，除去组蛋白和大部分非组蛋白后，在电镜下可观察到由非组蛋白构成的染色体骨架(chromsomalscaffold)和由骨架伸出的无数的DNA侧环(图8—12)。此外实验观察发现，不论是原核细胞(E．coli)的染色体还是两栖类卵母细胞的灯刷染色体或昆虫的多线染色体，几乎都含有一系列的环状结构域(100ped domains)，从而提示环状结构可能是染色体高级结构的普遍特征(图8—13)。

关于染色体骨架和染色质袢环的研究证据，使染色体袢环结构模型近年来引起人们的重视。该模型认为，30 nm的染色线折叠成环，沿染色体纵轴，由向四周伸出，构成放射环。J．Painta和D．Coffey(1984)对该模型进行了较详细的描述。首先是直径2 nm的双螺旋DNA与组蛋白八聚体构建成连续重复的核小体串珠结构，其直径10 nm。然后按每圈6个核小体为单位盘绕成直径 30nm的螺线管。由螺线管形成DNA复制环，每18个复制环呈放射状平面排 列，结合在核基质上形成微带(miniband)。微带是染色体高级结构的单位，大约 10‘个微带沿纵轴构建成子染色体(表8—4)。 上述两种关于染色体高级结构的组织模型，前者强调螺旋化，后者强调环化与折叠。两者都有一些实验与观察的证据，也许在不同的包装阶段这些机制共同起作用，因此以下图作为融两种机制在内的染色质包装模型(图8—14)。

四、常染色质和异染色质

问期染色质按其形态特征和染色性能区分为两种类型：常染色质(euchromatin)和异染色质(heterochromatin)。 常染色质是指间期核内染色质纤维折叠压缩程度低，处于伸展状态，用碱性染料染色时着色浅的那些染色质。在常染色质中，DNA包装比约为1/2000—1/1000，即DNA实际长度为染色质纤维长度的1 000～2 000倍。构成常染色质的DNA主要是单一序列DNA和中度重复序列DNA(如组蛋白基因和tRNA基因)。常染色质并非所有基因都具有转录活性，处于常染色质状态只是基因转录的必要条件，而不是充分条件。 异染色质是指间期核中，染色质纤维折叠压缩程度高，处于聚缩状态，用碱性染料染色时着色深的那些染色质。异染色质又分结构异染色质或组成型异染色质(constitutive heterochromatin)和兼性异染色质(facultative heterochromatin)。结构异染色质指的是各种类型的细胞，除复制期以外，在整个细胞周期均处于聚缩状态，DNA包装比在整个细胞周期中基本没有较大变化的异染色质。在间期核中，结构异染色质聚集形成多个染色中心

(chromocenter)，在哺乳类细胞中，这些染色中心随细胞类型和发育阶段而变化。结构异染色质有如下特征：①在中期染色体上多定位于着丝粒区、端粒、次缢痕及染色体臂的某些节段；②由相对简单、高度重复的DNA序列构成，如卫星DNA；③具有显著的遗传惰性，不转录也不编码蛋白质；④在复制行为上与常染色质相比表现为晚复制早聚缩；⑤占有较大部分核DNA，在功能上参与染色质高级结构的形成，导致染色质的区间性，作为核DNA的转座元件，引起遗传变异。兼性异染色质是指在某些细胞类型或一定的发育阶段，原来的常染色质聚缩，并丧失基因转录活性，变为异染色质。这类兼性异染色质的总量随精品文档

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不同细胞类型而变化，一般胚胎细胞含量很少，而高度特化的细胞含量较多，说明随着细胞分化，较多的基因渐次以聚缩状态而关闭，从而再也不能接近基因活化蛋白。因此，染色质通过紧密折叠压缩可能是关闭基因活性的一种途径。例如雄性哺乳类细胞的单个X染色体呈常染色质状态；而雌性哺乳类体细胞的核内，两条X染色体之一在发育早期随机发生异染色质化而失活，在上皮细胞核内，这个异固缩的X染色体称性染色质或巴尔氏小体(Barrbody)，在多形核白细胞的核内，此X染色体形成特殊的“鼓槌”结构。因此，检查羊水中胚胎细胞的巴尔氏小体可以预报胎儿的性别。 第三节 染色体

染色体(chromosome)是细胞在有丝时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。 一、中期染色体的形态结构

中期染色体具有比较稳定的形态，它由两条相同的姐妹染色单体(sister chromatid)构成，彼此以着丝粒相连。根据着丝粒在染色体上所处的位置，可将中期染色体分为4种类型：中着丝粒染色体(metacentric chromosome)两臂长度相等或大致相等；近中着丝粒染色体(submetacentric cbromosome)；近端着丝粒染色体(acrocentric chromosome)具有微小短臂；端着丝粒染色体(telocentric chromosome)(图8—15；表8—5)。 染色体各部的主要结构： (1)着丝粒(centromere)与动粒(又称着丝点，kinetochore)：

着丝粒连接两个染色单体，并将染色单体分为两臂：短臂(p)和长臂(q)。由于着丝粒区浅染内缢，所以也叫主缢痕(primary constriction)。近年来的研究表明，着丝粒是一种高度有序的整合结构，在结构和组成上都是非均一的，至少包括三种不同的结构域：①沿着着丝粒外表面的动粒结构域

(kinetochore domain)。哺乳类动粒超微结构可分为三个区域：一是与着丝粒结构域相联系的内板(innerplate)；二是中间间隙(middle space)，电子密度低，呈半透明区；三是外板(outerplate)。在没有动粒微管结合时，覆盖在外板上的第4个区称为纤维冠(fibrouscorona)，由微管蛋白构成。动粒微管与内外板相连，并沿纤维冠相互作用，与内板相联系的染色质是与微管相互作用的位点。已有证据表明，动粒结构域的化学组成包括与动粒结构与功能相关的两类蛋白，以及着丝粒DNA，但是目前关于动粒的结构模型尚无定论。②结构域(central domain)，这是着丝粒区的主体，由串联重复的卫星DNA组成。这些重复序列大部分是物种专一的，人染色体的着丝粒DNA由卫星DNA组成，重复单位171 bp，每一着丝粒串联重复2 000—30 000次，可达250kb至400kb，但不同染色体着丝粒的卫星DNA序列存在差别。其中一个亚类含有17 bp的DNA模式 (5，CTTCGTTGGAAACGGGA3，)，能与动粒蛋白CENP—B结合，这一DNA模式被称为CENP—B框。根据免疫印迹(immunoblots)分析，在哺乳类染色体着丝粒区已发现CENP—A(17X103’)、B(80X103)、C(140XlO3)、

E(312X103’)和 F(330X103)5种动粒蛋白，这些动粒蛋白和细胞及其有密切关系，因而也是极为保守的。③位于着丝粒内表面的配对结构域

(pairingdomain)代表中期姐妹染色单体相互作用的位点。已经发现有两类蛋白：一是内部着丝粒蛋白INCENP(innercentromereprotein)；另一类是染色单体连接蛋白clips(chromatid linking proteins)，两者与染色单体配对有关(图8—16)。 精品文档

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虽然三种结构域具有不同的功能，但它们并不独自发挥作用，正是三种结构域的整合功能，确保了细胞在有丝中染色体与纺锤体整合，发生有序的染色体分离。 (2)次缢痕(secondary constriction) 除主缢痕外，在染色体上其他的浅染缢缩部位称次缢痕。它的数目、位置和大小是某些染色体所特有的形态特征，因此也可以作为鉴定染色体的标记。 (3)核仁组织区(nucleolar organizing region，NOR) 位于染色体的次缢痕部位，但并非所有次缢痕都是NOR。染色体NOR是 rRNA基因所在部位(5SrRNA基因除外)，与间期细胞核仁形成有关。 (4)随体(satellite) 指位于染色体末端的球形染色体节段，通过次缢痕区与染色体主体部分相连。它是识别染色体的重要形态特征之一，有随体的染色体称为sat染色体。 (5)端粒(telomere) 端粒是染色体两个端部特化结构。端粒通常由富含鸟嘌呤核苷酸(G)的短的串联重复序列DNA组成(TELDNA)，伸展到染色体的3’端。一个基因组内的所有端粒都是由相同的重复序列组成，但不同物种的端粒的重复序列是不同的。哺乳类和其他脊椎动物端粒的重复序列中的保守序列是TTAGGG，串联重复500～3 000次，序列长度在2kb到20 kb之间不等。端粒的生物学作用在于维持染色体的完整性和个体性，与染色体在核内的空间排布及减数时同源染色体配对有关。

二、染色体DNA的三种功能元件 在细胞世代中确保染色体的复制和稳定遗传，染色体起码应具备三种功能元件(functional elements)：一个DNA复制起点，确保染色体在细胞周期中能够自我复制，维持染色体在细胞世代传递中的连续性；一个着丝粒，使细胞时已完成复制的染色体能平均分配到子细胞中；最后，在染色体的两个末端必须有端粒，保持染色体的性和稳定性。构成染色体DNA的这三种关键序列 (key sequence)称为染色体DNA的功能元件(图8—17)。近年来采用分子克隆技术把真核细胞染色体的复制起点、着丝粒和端粒这三种DNA关键序列分别克隆成功，并把它们互相搭配或改造而构成所谓“人造微小染色体”(artificial minichromosome)。图8着丝粒

间期 r--1，I ，， II十\" \" \"，， \"日日 日日 L』L』于细胞复制的染色体真核细胞染色体的三种功能元件示意图(引自B．Alberts) 1自主复制DNA序列(autonomously replicating DNA sequence，ARS)

应用DNA重组技术，将带有正常酵母亮氨酸合成酶leu基因的DNA酶片段重组到大肠杆菌的质粒中，用这种重组质粒去转化亮氨酸合成代谢缺陷型酵母细胞，发现单纯质粒不能转化酵母细胞，而重组质粒能在酵母细胞中复制、表达和遗传，可见该酵母DNA插入片段除含有leu基因外，还含有一段酵母染色体自主复制的DNA序列，称为ARS。该序列首先在酵母基因组DNA序列中发现，它能使含有这一序列的重组质粒高效转化酵母细胞，并能在酵母中于宿主染色体而存在(图8—18)。根据不同来源的ARS的DNA序列分析，发现它们都具有一段11～14 bp的同源性很高的富含AT的共有序列(consensus sequence)，同时证明这段共有序列及其上、下游各200 bp左右的区域是维持 ARS功能所必需的。现在已利用双向电泳定位复制起点的技术，直接证明了 ARS在质粒以及酵母染色体上与复制起点(replication origin)共定位的现精品文档

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象。绝大多数真核细胞的染色体含有多个复制起点，以确保全染色体快速复制。现在还没有确定真核生物的复制起点的DNA序列是否具有固定模式，但大多包含一个富含AT的序列

2．着丝粒DNA序列(centromereDNAsequence，CEN)上述插入ARS的重组质粒，虽然能在酵母细胞中复制和表达，但由于它缺少着丝粒，因此不能在酵母细胞有丝时平均分配到子细胞中去。于是设法把酵母染色体上的着丝粒DNA序列(CEN)插人到这个含ARS的重组质粒中，结果这种新的插有酵母染色体的ARS和CEN序列的重组质粒，在有丝中便表现出与正常染色体相似的复制与分离行为。根据不同来源的CEN序列分析，发现它们的共同特点是有两个彼此相邻的核心区，一个是80～90 bp的AT区，另一个是11 bp的保守区。通过CEN缺失损伤试验或插入突变试验，发现 一旦伤及这两个核心区序列，CEN即表现丧失其生物学功能。

3．端粒DNA序列(telomereDNAsequence，TEL)

如果将插入ARS和CEN序列的环状重组质粒DNA在单一位点切开，形成一个具有两个游离端的线性DNA分子，虽然可以在酵母细胞中复制并附着到有丝的纺锤体上，但最终要从子细胞中丢失，结果细胞无法生长。如果在切开的线性DNA两端加上TEL序列，则转染细胞生长。这是因为环状DNA变成线性DNA分子以后无法解决“末端复制问题”，即新合成的DNA链5’末端 RNA引物被切除后变短的问题。真核细胞染色体端粒的重复序列不是染色体 DNA复制时连续合成的，而是由端粒酶(telomerase)合成后添加到染色体末端。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，具有逆转录酶的性质，以物种专一的内在的 RNA作模板，把合成的端粒重复序列再加到染色体的3，端(图8—19)。人的生殖系细胞染色体末端比体细胞染色体末端长几千个碱基对，这是因为迄今为止只发现在生殖系细胞和部分干细胞里有端粒酶活性，而在所有体细胞里则尚未发现端粒酶的活性。因此，端粒起到细胞计时器的作用。不管是体内还是体外，体细胞每一次，端粒重复序列就缩短一些。表明端粒重复序列的长度与细胞次数和细胞的衰老有关。肿瘤细胞具有表达端粒酶活性的能力，使癌细胞得以无地增殖。 三、核型与染色体显带

核型(karyotype)一词在20世纪20年代首先由苏联学者T．A．Levzky等人提出。核型分析的发展有三项技术起了很重要的促进作用。一是1952年美籍华人细胞学家徐道觉发现的低渗处理技术，使中期细胞的染色体分散良好，便于现察；二是秋水仙素的应用便于富集中期细胞相；三是植物凝集素(PHA) 刺激血淋巴细胞转化、，使以血培养方法观察动物及人的染色体成为可能。 核型是指染色体组在有丝中期的表型，包括染色体数目、大小、形态特 征等。核型分析是在对染色体进行测量计算的基础上，进行分组、排队、配对并进行形态分析的过程。核型分析对于探讨人类遗传病的机制、物种亲缘关系与进化、远缘杂种的鉴定等都有重要意义。将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像称为核型模式图(idiogram)，它代表一个物种的核型模式(图8—20)。

在染色体显带技术发展之前，核型分析主要是根据染色体形态和着丝粒位置的差别来进行的，但有时对染色体仍不易精确识别和区分。1968年由瑞典细胞学家Casperson首先建立的染色体Q带技术及其以后的发展，为核型研究提精品文档

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供了有力的工具。Q带技术即喹吖因荧光染色技术，显示中期染色体经氮芥喳吖因或双盐酸喹吖因染色以后，在紫外线照射下呈现出荧光亮带和暗带。一般富含AT碱基的DNA区段表现为亮带，富含GC碱基的DNA区段表现为暗带。 G带即Giemsa带，将中期染色片经胰酶或碱、热、尿素、去污剂等处理后再用Giemsa染料染色后所呈现的染色体区带。一般来说，G带与Q带相符，但也有例外，如Q带显示的人Y染色体的特异荧光，在G带带型上并不出现。R带是指中期染色体经磷酸盐缓冲液保温处理，以吖啶橙或Giemsa染色后所显示的带型，和G带明暗相间带型正好相反，所以又称反带(reverse bands)。C带主要显示着丝粒结构异染色质，及其他染色体区段的异染色质部分。T带又称末端带(terminal bands)，是染色体端粒部位经吖啶橙染色后所呈现的区带，在分析染色体末端结构畸变时有用。N带又称Ag—As染色法，主要用于染核仁组织者区的酸性蛋白质。1975年以来，美国细胞遗传学家Yunis等建立了染色体高分辨显带技术，用氨甲喋呤使培养的细胞同步化后，再用秋水仙胺短暂处理，获得大量晚前期和早中期相，这些时期的染色体比典型中期染色体长，显带后可得到更多更细的带纹。在人体细胞晚前期染色体组中可以分辨出843～1 256条带，而中期染色体只能观察到320～550条带，这更有助于发现细微的染色体异常。

染色体显带技术最重要的应用就是明确鉴别一个核型中的任何一条染色体，乃至某一个易位片段。同时显带技术也用于染色体基因定位和研究物种的核型进化及可能的进化机制，如染色体着丝粒的罗伯逊式融合(Robertsonianfusion)与染色体着丝粒的罗伯逊式断裂(Robertsonianfission)。

从人到果蝇，有丝的染色体普遍存在特殊的带型。一个物种某一条染色体上的标准带型在进化上是非常稳定的特征。这就提示，染色体带作为更大范围的结构域对细胞的功能可能是重要的。有人估计，即使最细的带纹也应含有30或更多的环状结构域，并且已知富含AT的带和富含GC的带都含有基因。近年来发展的显带染色体显微切割和分子微克隆技术，已有可能研究染色体某几个带纹的DNA性质，这是联系细胞遗传学与分子遗传学之间的重要桥梁。 巨大染色体

在某些生物的细胞中，特别是在发育的某些阶段，可以观察到一些特殊的、体 积很大的染色体，包括多线染色体(polytene chromosome)和灯刷染色体(1ampbrush chromosome)，这两种染色体总称为巨大染色体(giant chromosome)。 (一)多线染色体

多线染色体是1881年由意大利细胞学家Balbiani首先在双翅目摇蚊幼虫的唾腺细胞中发现的，它存在于双翅目昆虫的幼虫组织细胞，如唾腺、气管、肠和马尔比基氏管。此外，在不同植物的不同类型的细胞中，如胚珠细胞(胚乳、胚柄和反足细胞)，也发现多线染色体。 1．多线染色体的来源

多线染色体来源于核内有丝(endomitosis)，即核内DNA多次复制而细胞不，产生的子染色体并行排列，且体细胞内同源染色体配对，紧密结合在一起，从而阻止染色质纤维进一步聚缩，形成体积很大的多线染色体。多线化的细胞处于永久间期，并且体积也相应增大。同种生物的不同组织以及不同生物的同种组织的多线化程度各不相同。在果蝇唾腺细胞中，染色体进行10次 精品文档

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DNA复制，因而形成210=1 024条同源DNA拷贝，形成的多线染色体比同种有丝染色体长200倍以上，4条配对的染色体全长可达2 mm。配对染色体的异染色质部位结合在一起形成的染色中心，复制次数很少(图8—21)。 2．多线染色体的带及间带

光镜下观察多线染色体，可见一系列交替分布的带和间带(interbands)，每条带和间带代表了由1 024个拷贝并行排列的染色质环状结构域彼此对应包装的结果(图8—22)。

在多线染色体上估计有85％的DNA分布在带上，15％的DNA分布在间带。带区的染色质包装程度比间带染色质高得多，所以带区呈现深染而间带浅染。在果蝇总基因组中，约有5 000条带和5 000条间带。每条染色质纤维的带区约含3 000～300 000bp(取决于带的宽窄)。多线染色体上带的数目、形态、大小及分布位置都很稳定。每条带能根据它的宽窄及间隔予以识别，对每条带给以标号，从而得到多线染色体的带谱。 3．多线染色体与基因活性

在果蝇个体发育的某个阶段，多线染色体的某些带区变得疏松膨大而形成胀泡(puff)。最大的胀泡叫Balbiani环。用3H标记的尿嘧啶核苷掺人多线染色体，放射自显影检测，发现胀泡被标记，说明胀泡是基因活跃转录的形态学标志 (图8—23)。控制果蝇多线染色体基因转录活性的主要因素之一是蜕皮激素 (ecdysone)。这种激素水平在幼虫发育期间周期性地变化，从而诱导那些编码每次蜕皮和蛹化所需要的蛋白质的基因转录。因此，胀泡的出现、发育和消失过程直接反映了基因转录的活性谱。

早期遗传学分析认为，果蝇多线染色体一条带代表一个基因，一个基因编码一种基本蛋白。Bossy等(1984)在果蝇基因组中，克隆出一段315 kb的连续 DNA序列，以该DNA为探针，检测该区段DNA所转录的mRNA，结果发现 mRNA的种类是被鉴定的带的数目的3倍，所以把每条带看作代表一个特异的

基因区更为恰当。最近的研究表明，多线染色体的带和间带都含有基因，有可能持家基因(housekeeping gene)位于间带，而有细胞类型特异性的“奢侈”基因 (1uxury gene)位于带上。 (二)灯刷染色体

灯刷染色体在1882年由W．F1emming在研究美西螈卵巢切片时首次报道，但由于其形态特殊而未能肯定。12年，Rukert研究鲨鱼卵母细胞时，给灯刷染色体以正式命名。现已知道，灯刷染色体几乎普遍存在于动物界的卵母细胞 中，其中两栖类卵母细胞的灯刷染色体最典型，也研究得最深入(图8—24)。在植物界，也有灯刷染色体的报道，如垂花葱(Allium cernruum)和玉米雄性配子减数中出现不很典型的灯刷染色体，而大型的单细胞藻类地中海伞藻(Acetabulariamediterranea)却有典型的灯刷染色体。图8—24 两栖类卵母细胞中的一个灯刷染色体(引自J．G．Gall) 1．灯刷染色体的超微结构

灯刷染色体是卵母细胞进行减数第一次时停留在双线期的染色体，它是一个二价体，包含4条染色单体，此时同源染色体尚未完全解除联会，因此可见到几处交叉。这一状态在卵母细胞中可维持数月或数年之久。

灯刷染色体轴由染色粒轴丝构成，每条染色体轴长约400m(多数有丝染色体<10m)。从染色粒向两侧伸出两个相类似的侧环，每个环相当于一个环状结构域，一个平均大小的环约含100kbDNA。两栖类一套灯刷染色体约含一万精品文档

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个这样的染色质侧环，不同的侧环有各自的特异DNA序列，每个环在细胞中有4个拷贝(图8—25)。

2．灯刷染色体的转录功能

灯刷染色体的形态与卵子发生过程中营养物储备是密切相关的。大部分 DNA以染色粒形式存在，没有转录活性，而侧环是RNA活跃转录的区域，一个侧环往往是一个大的转录单位或几个转录单位组合构成的。转录的RNA副本 3，端借助RNA聚合酶固定在侧环染色质轴丝上，游离的5’端捕获大量蛋白质形成核糖核蛋白复合物，组成环周围的基质，环的粗细变化表示基质的厚薄和转录 RNA的长短。转录起始点RNA短，随着RNA聚合酶读码而逐渐延长。用 RNase和蛋白酶可将基质消化，侧环轴丝保留，改用DNase消化，侧环轴丝解体消失，说明基质由RNP组成，轴丝由DNA组成。灯刷染色体合成的RNA主要 为前体mRNA(hnRNA)，有些类型的mRNA可翻译成蛋白质，有些mRNA与蛋 白质结合，暂不翻译而储存在卵母细胞中。 第四节 核仁

核仁(nucleolus)是真核细胞间期核中最显著的结构。在光镜下被染色的细 胞、相差显微镜下的活细胞或分离细胞的细胞核都容易看到核仁，它们通常表现 为单一或多个匀质的球形小体。核仁的大小、形状和数目随生物的种类、细胞类 型和细胞代谢状态而变化。蛋白质合成旺盛、活跃生长的细胞如分泌细胞、卵母 细胞，其核仁大，可占总核体积的25％，不具蛋白质合成能力的细胞如肌肉细 胞、休眠的植物细胞，其核仁很小。在细胞周期过程中，核仁又是一个高度动态 的结构，在有丝期间表现出周期性的消失与重建。 真核细胞的核仁具有重要功能，它是rRNA合成、加工和核糖体亚单位的装配场所。因此对核仁结构、动态和功能的研究，不仅为早期细胞学家所密切注意，而且自20世纪60年代发现核仁重要功能以后，也一直受到各相关领域研究者的高度重视。 一、核 仁 的超微结构

电镜下核仁的超微结构与胞质中的大多数细胞器不同，它没有被膜包裹。尽管核仁的大小、形态和超微结构明显地随所研究的细胞类型和细胞的代谢状态而变化，但三种基本的核仁结构组分仍可通过超薄切片的电镜观察加以识别 (图8—26)。周边异染色质核被膜银粒颗粒组分图8—26 BHK—21细胞核仁的电镜照片(丁明孝)

银颗粒示rRNA转录部位 1．纤维中心

在电镜下观察，纤维中心(fibrillarcenters，FC)是包埋在颗粒组分内部一个或几个浅染的低电子密度的圆形结构小岛，根据电镜细胞化学和放射自显影研究已经确证，在纤维中心存在rDNA、RNA聚合酶I和结合的转录因子，并且光镜及电镜水平的原位分子杂交也证明了这种DNA具有rRNA基因(rDNA)的性质。根据形态相似性和嗜银蛋白的存在，通常认为FC代表染色体NORs在间期核的副本。然而由于核仁活性的变化，FC的数目可能超过染色体NORs的数目。并且有证据表明，FC中的染色质不形成核小体结构，也没有组蛋白存在，但存在嗜银蛋白，其中磷蛋白C23的存在已得到免疫电镜的证明，并认为它是和 rDNA结合在一起的，可能与核仁中染色质结构的调节有关。 2．致密纤维组分

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在电镜下观察，致密纤维组分(dense fibrillar component，DFC)是核仁超微 结构中电子密度最高的部分。呈环形或半月形包围FC，由致密的纤维构成，通常见不到颗粒。用3H—U作为RNA前体物对细胞进行脉冲标记，根据电镜放射自显影观察，带放射性标记的第一个核仁结构就是DFC，电镜原位分子杂交也证明rRNA以很高的密度出现在DFC区域。此外发现DFC还有特异性结合蛋白，其中比较清楚的是fibrillarin、核仁素(nucleolin)和Ag—NOR蛋白。 3．颗粒组分

在代谢活跃的细胞的核仁中，颗粒组分(granular component，GC)是核仁的主要结构，由直径15～20 nm的核糖核蛋白(RNP)颗粒构成，可被蛋白酶和 RNase消化，这些颗粒是正在加工、成熟的核糖体亚单位前体颗粒，间期核中核仁的大小差异主要是由颗粒组分数量的差异造成的。除上述三种基本核仁组分外，在电镜下观察超薄切片时会发现，核仁虽然没有膜包裹，但被或多或少的染色质所包围，这层染色质称为核仁相随染色质(nucleolarassociated chromatin)，有时还深入到核仁内，称为核仁内染色质

(intranucleolarchromatin)，而包围核仁的染色质称为核仁周边染色质

(perinucleolar chromatin)。此外，应用RNase和 DNase处理核仁，在电镜下看到核仁的残余结构，称为核仁基质(nucleolarma— trix)或核仁骨架。FC、DFC和GC三种组分都湮没在这种无定形的核仁基质中。

现有研究资料普遍认为，上述三种基本核仁组分以某种方式和rRNA的转录与加工形成RNP的不同事件有关。新近比较一致的看法认为，FCs是rRNA基因的储存位点，转录主要发生在FC与DFC的交界处，初始rRNA转录物首先出现在DFC并在那里加工；某些加工步骤也发生在颗粒组分区(GC)，并负责将rRNA与核糖体蛋白装配成核糖体亚单位，所以GC代表核糖体亚单位成熟和储存的位点。然而，关于rRNA基因转录的确切位点仍有不同见解。

二、核仁的功能

核仁的主要功能涉及核糖体的生物发生(ribosome biogenesis)，这是一个向量过程(vetorical process)，从核仁纤维组分开始，再向颗粒组分延续。这一过程包括rRNA的合成、加工和核糖体亚单位的装配。 (一)rRNA基因转录的形态及组织特征

染色体原位分子杂交(in situ hybridization)证实rRNA基因(rDNA)定位于染色体的核仁组织区。用放射性标记的rRNA为探针与黑腹果蝇总DNA杂交，发现杂交程度与果蝇染色体NORs存在的数目正相关。在不含NORs的非洲爪蟾突变体中，不能合成rRNA及核糖体，也不能形成核仁。这些事实表明，位于NORs的rDNA是rRNA的信息来源(图8—27)。

目前，纯粹用形态指标还不能识别原位固定的细胞核中的rRNA基因，若观察具有转录活性的rRNA基因，需要破坏核仁的整合结构，使rRNA基因从拓扑约束中释放出来。最初由Miller及其同事(19)提出的染色质铺展技术，对于 了解rRNA基因的组织、排列和染色质结构作出了重要贡献，使人们有可能在电镜标本上看到由rRNA基因转录成rRNA的形态学过程。根据在两栖类卵母细胞和其他细胞中具有转录活性的rRNA基因的电镜观察结果，发现rRNA基因 在染色质轴丝上呈串联重复排列；沿转录方向，新生的rRNA链逐渐增长，形成“圣诞树”样结构；转录产物的纤维游离端(5，端)首先形成RNP颗粒。这些形态特征是最直观的rRNA基因转录的证据(图8—28)。 精品文档

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真核生物核糖体含有4种rRNA，即5．8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA及 5SrRNA，其中前三种的基因组成一个转录单位。与为蛋白质编码的mRNA不同，rRNA分子是rRNA基因的最终产物，处于生长中的高等真核细胞一般都有 107个核糖体以确保蛋白质合成机制的运转，这意味着每一细胞世代必须合成每一类型rRNA分子107拷贝，这需要相应增加基因“剂量”，并高度有效地转录。在真核细胞中，随物种的不同，有100～5 000个rRNA基因拷贝串联成重复序列，成簇分布在少数染色体NORs上。人单倍体基因组含有200个rRNA基因拷贝，成簇分布在5条不同的染色体上；爪蟾单倍体基因组含有600个 rRNA基因拷贝，单一丛集在一条染色体上。这些rRNA基因是由专一性的 RNA聚合酶I进行转录的。一般情况下，这些rRNA基因拷贝数是不变的，因此主要依赖于转录起始的速率。这种成簇分布的串联重复排列的rRNA基因被组织在很小的核仁区域，一方面增加了启动子的局部浓度，另一方面串联重复基因本身就使得专一的RNA聚合酶I在一个转录单位内进行连续运作，即在转录前一个基因之后并不解离而是活化第二个基因的转录。这种组织方式和高密度分布、专一性的RNA聚合酶I，使rRNA基因的转录能够采取受控的级联放大机制。 (二)rRNA前体的加工

每个rRNA基因转录单位由RNA聚合酶I转录产生相同的初始转录产物 rRNA前体，不同生物的rRNA前体大小不同，哺乳类为45S rRNA(约13 000个核苷酸)，果蝇为38S rRNA，酵母为37S rRNA。由于真核生物的rRNA加工过程比较缓慢，其中间产物可从各种细胞中分离出来，因此真核生物的rRNA加工过程比较清楚。用3H—U标记HeLa细胞的RNA，则可通过凝胶电泳分离到 45SrRNA前体以及41S、32S、20S等加工产物。通过标记动力学实验，证明它们是rRNA加工过程中的前体和中间物。它们的加工过程如图8—29所示。 在真核生物中，5S rRNA基因(120bp)不定位在NORs，人约有2 000个5S rRNA基因，也是成簇串联排列的，中间同样间隔以不被转录的片段，由RNA聚合酶Ⅲ所转录，5S rRNA转录后经适当加工即参与核糖体大亚单位的装配。 在核糖体生物发生过程中，rRNA前体被广泛修饰与加工，涉及一系列的核酸降解切割以及碱基修饰，每个rRNA分子修饰产生100个左右2／—O—甲基核糖和90个左右假尿嘧啶核苷残基。在rRNA成熟过程中，一类小分子核仁核糖核蛋白(small nucleolar ribonucleoproteins，snoRNPs)作为引导RNA(guide RNA)参与RNA的编辑加工过程，其编辑的靶位点可能与那些被修饰的残基有关。

(三)核糖体亚单位的装配

45S rRNA前体转录以后很快与蛋白质结合，因此，rRNA前体的加工过程 是以核蛋白而不是游离rRNA的方式进行的。根据带有放射性标记的核仁组分的分析，发现完整的45S rRNA前体首先与蛋白质结合被包装成80S的RNP复合体。在加工过程中，80S的RNP再逐渐失去一些RNA和蛋白质，然后剪切形成两种大小不同的核糖体亚单位前体(图8—30)。通过放射性脉冲标记和示踪实验表明，在30min内，首先成熟的核糖体小亚单位(含有18S rRNA)在核仁产生并很快出现在细胞质，而28S、5．8S和5S rRNA装配成核糖体大亚单位约需1 h完成，所以核仁含有的核糖体大亚单位比小亚单位多得多。加工下来的蛋白质和小的RNA存留在核仁中，可能起着催化核糖体构建的作用。

一般认为，核糖体的成熟作用只发生在它们的亚单位被转移到细胞质以后，因而有利于阻止有功能的核糖体与核内加工不完全的hnRNA分子接近。 精品文档

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核仁除上述rRNA的合成、加工和核糖体亚单位装配的主要功能之外，另一个功能涉及mRNA的输出与降解。最初的观察发现，哺乳类细胞通过紫外线照射灭活核仁，可阻止非核糖体RNA的输出。虽然在高等真核细胞大量poly(A) RNA并不定位于核仁，但是一些特殊的mRNA(如MyoD、N—myc的转录物)已在核仁中检测到。进而在酵母中发现，mtrl—1和mtr2—1基因突变或重度热休克(severeheatshock)会干扰mRNA的运输，结果导致poly(A)RNA在核仁中的积累。

三、核仁周期

在细胞周期中，核仁是一种高度动态的结构，在形态和功能上都发生很大的变化。当细胞进入有丝时，核仁首先变形和变小，然后随着染色质凝集，核仁消失，所有RNA合成停止，致使在中期和后期细胞中没有核仁；在有丝末期，rRNA合成重新开始，核仁的重建随着核仁物质聚集成分散的前核仁体 (prenucleolar body，PNBs)而开始，然后在NORs周围融合成正在发育的核仁。

在细胞周期中核仁周期(nucleolar cycle)性变化的分子过程还不十分清楚，但近几年来的研究表明，核仁的动态变化是rDNA转录和细胞周期依赖性的。在细胞周期的间期，核仁结构整合性(structure integrity)的维持，以及有丝后核仁结构的重新建成，都需要rRNA基因的活性。用带有荧光标记的RNA聚合酶I抗体显微注射到体外培养的PtK2细胞核中，rRNA基因的转录被选择性抑制，通过双标记免疫荧光显微术(double label immunofluorescence microscopy)和电镜观察发现，注射RNA聚合酶I抗体后，DFC很快开始去整合并导致核仁解体，核质内充满大量核仁外体(extranucleolarbody)，用fibriUarin抗体染色证明，这些核仁外体具有DFC性质，残余的核仁失去

DFC，主要由FC和 GC组成。由此可见，DFC在核仁中的定位与整合，关键依赖于正在转录的 rRNA基因。

采用上述相同的方法，将RNA聚合酶I抗体注射到有丝中期的细胞

内，被注射的细胞虽然能继续完成并且子细胞按正常周期运转进入Gl期， 但它们却不能重建核仁，而是在核中充满许多PNBs。PNBs含有fibrillarin及其他核仁蛋白，但没有RNA聚合酶I和拓扑异构酶I，也没有rDNA。结果表明，预先形成的PNBs围绕染色体NORs重建核仁，同样需要RNA聚合酶I的活性，rRNA基因转录的抑制是阻止核仁重建的早期步骤。

第五节 染色质结构和基因转录

按功能状态的不同可将染色质分为活性染色质(active chromatin)和非活性染色质(inactive chromatin)。对绝大多数细胞而言，在特定阶段具有转录活性的基因只占基因总数的10％以下，而90％以上的基因在转录上是不活跃的。所谓活性染色质是指具有转录活性的染色质；非活性染色质是指没有转录活性的染色质。

活性染色质由于核小体构型发生构象改变，往往具有疏松的染色质结构，从而便于转录因子与顺式元件结合和RNA聚合酶在转录模板上滑动。当染色质结构处于疏松状态时，利用核心组蛋白H3暴露出来的游离巯基与有机汞的亲和性，可采用有机汞亲和层析和二硫苏糖醇(DTT)洗脱的方法将活性染色质分离出来。

一、活性染色质的主要特征

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(一)活性染色质具有DNaseI超敏感位点当染色质用DNase I消化时，可将染色质降解成酸溶性的DNA小片段。若从鸡红细胞中提取染色质进行上述处理，发现珠蛋白基因很快就被降解，而卵清蛋白基因的降解程度则很低。相反，若从鸡输卵管细胞中提取染色质作同样处理，则优先降解的是卵清蛋白基因而不是珠蛋白基因。结果表明，凡有基因表达活性的染色质DNA，对DNase I的降解作用比没有转录活性的染色质 DNA要敏感得多。进一步发现，正在转录或具有潜在转录活性而未转录的基因对DNase I同样敏感，说明活化染色质对DNase I的优先敏感性(preferential sensitivity)不是由于转录过程中RNA聚合酶的作用，而是可转录染色质的一个基本特征。用DNase I处理染色质时，优先释放出两种高迁移组分(high mobility group)非组蛋白，它们是HMGl4和HMGl7。当把这两种非组蛋白从鸡红细胞染色质中用低盐溶液抽提出来以后，珠蛋白基因就不再表现出对DNase I的优先敏感性，而在盐抽提过的染色质中加入这两种非组蛋白后，敏感性又可恢复，说明活化染色质对DNaseI的优先敏感性与这两种非组蛋白有关。然而，把这两种蛋白加入盐抽提过的鸡脑细胞染色质后，其中的珠蛋白基因并不表现出对DNase I的优先敏感性，说明这些HMG蛋白质又不是造成这种优先敏感性的惟一原因。红细胞和脑细胞中一定还存在其他因子的差异，这些因子决定了红细胞的珠蛋白基因在HMGl4和HMGl7存在时对DNase I敏感。

如用很低浓度的DNase I处理染色质，切割将首先发生在少数特异性位点上，这些特异性位点叫做DNase I超敏感位点 (DNase l hypersensitivesite)。超敏感位点的存在是活性染色质的特点。若用游离DNA作底物则无超敏感位点出现。通过对大量基因进行的试验发现，每个活跃表达的基因都有一个或几个超敏感位点，大部分位于基因5，端启动子区域，少部分位于其他部位，如转录单位的下游。并且发现，5，端超敏感位点只出现在基因正在活跃表达的细胞中，而该基因不表达的细胞中则不存在。例如，对于鸡夕珠蛋白基因簇，胚胎阶段超敏感位点出现在胚胎型基因而不是成体型基因的5’端；而在成体阶段情况则恰好相反，超敏感位点出现在成体型而不是胚胎型\"珠蛋白基因的5，端。这说明超敏感位点和基因活性有一定的关系。现已知道，超敏感位点实际上是一段长 100--200 bp的DNA序列特异暴露的染色质区域。由超敏感位点所代表的染色质结构变化，可能在于超敏感序列首先与其他蛋白质结合而阻止核小体的装配。这样，该序列不被组蛋白八聚体所保护，所以一个典型的超敏感位点区对核酸酶攻击的敏感性是其他染色质区域的100倍以上。活性基因的超敏感位点建立在启动子附近，并与启动子功能有关，很可能是为RNA聚合酶、转录因子或其他蛋白因子提供结合位点。现有证据表明5，端超敏感位点的建立发生在转录起始之前，但很可能是起始转录的必要条件而非充分条件。有人为说明超敏感位点的稳定性，用温度敏感的肿瘤病毒转化导致珠蛋白基因的激活，并建立超敏感位点；如果转化在非许可的较高温度下完成，则珠蛋白基因不被激活，也不出现超敏感位点；在低温下珠蛋白基因被转化激活后，若提高温度可使其失活而不表达，但已建立的超敏感位点却至少要保持到细胞复制20次以后。这一结果也证实了超敏感位点的建立只是起始转录所必要的特征之一，但建立超敏感位点的事件与保持该位点的事件可能是不同的。

(二)活性染色质在生化上具有特殊性

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根据对活性染色质蛋白组分的生化分析发现：①活性染色质很少有组蛋白 H1与其结合；②活性染色质的4种核心组蛋白虽然以常量存在，但是与非活性染色质相比较，活性染色质上的组蛋白乙酰化程度高；③与非活性染色质相比，活性染色质的核小体组蛋白H2B，很少被磷酸化；④核小体组蛋白H2A在许多物种包括果蝇和人的活性染色质中很少有变异的形式存在；⑤HMG蛋白(high mobilitygroupproteins)是染色体非组蛋白中一组较丰富、不均一、富含电荷的蛋白质。其中HMGl4和HMGl7只存在于活性染色质中，与DNA结合。平均每 10个核小体中有1个核小体是与HMGl4和HMGl7结合的，其氨基酸序列在进化中高度保守，表明它们有重要功能。

二、染色质结构与基因转录

真核生物核内DNA盘绕组蛋白核心形成核小体，而不以裸露状态存在。随着20世纪70年代核小体结构的发现，提出了一个迄今尚无满意答案的重要问题，那就是RNA聚合酶与转录因子这类非组蛋白如何能与同组蛋白核心紧密结合的DNA相互作用?实际上，大量证据似乎表明DNA与核小体的结合，阻断了DNA与转录因子和基础转录装置的接近，从而阻断了转录的进行。但同时，又有些证据表明，DNA在与组蛋白形成复合物的情况下仍可被转录。当前研究染色质结构的改变与基因活化的关系主要集中在如下三个方面：一是如何形成活性染色质中的超敏感位点以便RNA聚合酶能起始转录；二是具有转录活性的染色质结构域如何与周围的非活性区域隔离；三是RNA聚合酶如何通过与组蛋白结合的DNA模板进行转录。 (一)疏松染色质结构的形成

染色质的疏松状态源于核小体的松散或缺失，根据核小体结构与功能的关系，可能有以下原因引起核小体的松散或缺失： 1．DNA局部结构的改变与核小体相位的影响

和细胞其他部分一样，染色质并不是一个静止的结构，而是一个活泼、动态、可塑的蛋白质与核酸组成的复合体。当一个蛋白结合到染色质DNA的一个特定的位点上时，不管是在核小体间还是在一个核小体内，染色质很容易被引发二级结构的改变。这些改变随后引起其他的一些结合位点与蛋白的结合或者更加容易或者更加困难。有证据表明，结合到 DNA上的基因蛋白在相当远的地方都能发生其影响。比 如，某一特定的转录因子结合到 离某基因较远的增强子序列上有利 于在该基因较近的TATA框序列上进行前起始复合体的装配 该复合体一旦装 以通过转录因子而联系配后，就可以作为转录因子与其他位点结合的“靶”，结果使染色质上某一特定区域从转录非活化状态转变成转录活化状态。似乎细胞具有某些“工具”能撬开被核小体阻断的DNA区域，以便允许转录因子与DNA接触。例如酵母和人类细胞具有一种多亚基复合物SWI／SNF，利用ATP水解释放的能量破坏组蛋白与DNA之间的相互作用，使转录因子得以同基因区结合。此外，不同的拓扑异构酶能调整DNA双螺旋的局部构象和高级结构的变化，使之超螺旋或松弛。实验发现拓扑异构酶Ⅱ抑制果蝇hsp基因的转录；拓扑异构酶I分布于 果蝇多线染色体中具转录活性的基因座；B型DNA(右旋)变成Z型DNA(左旋)，会导致核心组蛋白八聚体与DNA的亲和力降低。核小体并非沿DNA随机分布，而是通常定位在特殊位点，一种情况是基因关键元件(增强子和启动子)位于核小体颗粒之外，使之便于与转录因子结合(图8—3lA)；另一种情况是基因元件位于盘绕核心组蛋

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白的DNA上，则增强子和启动子两种元件通过转录因子被联系起来(图8—3lB)。

2．组蛋白的修饰

组成核小体的组蛋白八聚体的N端都暴露在核小体之外，某些特殊的氨基酸残基会发生乙酰基化、甲基化、磷酸化或ADP核糖基化等修饰。这些基团修饰的意义，一是改变染色质的结构，直接影响转录活性；二是核小体表面发生改变，使其他蛋白易于和染色质相互接触，间接影响转录活性。 (1)核心组蛋白的赖氨酸残基乙酰基化(acetylation)

组蛋白的赖氨酸残基乙酰基化是核小体重建的一种重要方式。乙酰基化后的组蛋白赖氨酸侧链不再带有正电荷，这样就失去了与DNA紧密结合的能力，使相邻核小体的聚合受阻，同时影响泛素与组蛋白H2A的结合，导致蛋白质的选择性降解。组蛋白H3和H4是蛋白酶修饰的主要位点，它们的乙酰基化可能有类似促旋酶(gyrase)的活性，使核小体间的DNA因产生过多的负超螺旋易于从核小体上脱离，致使对核酸酶敏感性增高，并有利于转录因子的结合。人们早就发现，增加赖氨酸的甲基化程度与转录水平的提高有关联，但近年来负责组蛋白乙酰基化的酶才被鉴定，并分析了这些酶的性质。同样，近年来还发现大量的辅激活子(coactivator)具有组蛋白乙酰转移酶(histone

acetyltransferase)的功能，将乙酰基从乙酰CoA供体转移到组蛋白特异的赖氨酸残基上。辅激活子作为一种接头蛋白，在DNA上游位点将转录因子同基础转录装置连接起来。通过具有组蛋白乙酰基转移酶活性的辅激活子的作用，特定的启动子可被看作是核小体解体的起始靶。由许多激素受体所介导的基因转录可以说明这一途径。激素受体和辅激活子(CBP)结合，CBP具有组蛋白乙酰基转移酶的活性，当这些受体与DNA上相应的激素应答元件(hormone response elements)结合时，同时与CBP辅激活子相互作用，CBP辅激活子转而使位于核心启动子区的核小体的组蛋白侧链乙酰基化，进而组蛋白乙酰基化打开启动子并促使转录装置的装配，从而导致相关基因的转录(图8—32)。

染色质的乙酰基化状态是一种动态过程，既有使组蛋白乙酰基化的酶，也有使组蛋白去乙酰基化的酶(histone deacetylase)。组蛋白去乙酰基化伴随着对转录的阻抑，实际上有许多转录辅阻抑物(transcriptional eo-repressor)作为组蛋白去乙酰化酶而发挥作用。通过比较活性X染色体(Xa)与失活X染色体(Xi)，我们可以发现：雌性哺乳动物中失活的X染色体上的H4组蛋白不发生乙酰基化，而雄性中有活性的X染色体上的H4都是乙酰基化的，前者不表达，后者表达；雌性哺乳动物中Xa和Xi的情况亦然，有活性的X染色体含有乙酰基化的组蛋白，而失活的X染色体其组蛋白则没有乙酰基化修饰。用乙酰基化H4的 抗体标记人和小鼠的中期染色体，除Xi外，其他染色体都被标记，所以中期染色体上H4乙酰基化程度的高低，可代表基因转录活性的高低。有人估计，H2B、 H3、H4可能具有32种不同的乙酰基化方式，而每种乙酰基化方式都可能使核小体结构发生改变，或使核小体上供结合蛋白识别的表面发生变化，从而对转录起始复合体的装配起不同的作用。 (2)组蛋白H1的磷酸化

组蛋白H1丝氨酸残基的磷酸化主要发生在有丝期。后，其磷酸化下降到峰值的20％。由于H1对核小体起装配作用，确定核小体的方向，并对 30nm的螺线管起维持稳定的作用，因此，H1磷酸化必然导致对DNA亲和力下降，造成染色质疏松，直接影响染色质的活性。此外H4组蛋白N端有特殊的氨精品文档

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基酸残基可与基因特异的激活因子相互作用，当发生氨基酸置换或删除时，便会改变特定基因的核小体相位。H3组蛋白C端结构域中的105和118位氨基酸残基正好处于它结合核小体二重对称轴(dyad axis)上的DNA与另一个H3组蛋白相连的位置，如果发生突变，便会影响蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA间的接触，使核小体不稳定，并可能导致H2A／H2B以及Hi从核小体上解离。 3．HMG结构域蛋白的影响

高速泳动的非组蛋白HMGl和HMG2有A、B和C三个结构域，A、B结构相似，C含有酸性的羧基端尾部，与H1结合。最近发现RNA聚合酶I系统的转录因子UBF的DNA结合单元是85个氨基酸残基的重复区，与HMGl和 MHG2的A、B结构相似，于是将这种特征性结构命名为“HMG\"结构域。与这一结构域相应的DNA序列称为\"HMGbox'’，而具有一个或多个HMG结构域的蛋白质称为HMG结构域蛋白。HMG结构域蛋白有细胞特异性，根据结构域拷贝数，序列识别特性和进化关系等分为两个亚簇，一个亚簇广泛存在于各种细胞中，如HMGl和

MHG2，UBF(RNA聚合酶I的转录因子)一般有多个HMG结构域，没有DNA识别特异性，执行不同的功能。另一个亚簇只存在于特定的细胞中，能识别特异的DNA序列，只有一个HMG结构域，如淋巴细胞增强子结合因子LEF—1、TCF—1和SRY。HMG结构域蛋白结合在DNA双螺旋的小沟中，以40倍的优势选择富含嘧啶的核苷酸元件。HMG结构域蛋白的功能之一是与DNA弯折和DNA—蛋白质复合体高级结构的形成有关。研究发现，HM(结构域可识别某些异型的DNA结构，可使DNA链产生90‘～130‘的弯折。一舶来说，小于150 bp的DNA双链很难自发形成环状结构，但在非特异的HMG1存在时，可改变DNA双螺旋结构，形成66bp的DNA环。具转录活性的核小僻常缺乏H1，但有非组蛋白HMGl4、HMGl7存在，在爪蟾中发现HMGl7会侦进RNA聚合酶Ⅲ的转录，HMGl4则直接参与RNA聚合酶Ⅱ对染色质中基区的转录等。 (二)染色质的区间性 1．基因座控制区

基因座控制区(locus control region，LCR)是染色体DNA上种顺式作用勇 件，其结构域中含有多种反式作用因子的结合序列，可能参与蛋白质因子的协同作用，使启动子处于无组蛋白状态，即LCR具有稳定染色质疏松结构的功能；S外多种反式作用因子的结合序列可保证DNA复制时与启动子结合的因子仍然保持在原来的位置上。不同的LCR可通过特异结合因子的导向结合在相关基因的启动子上，使相关基因或基因簇在基因组中表达增强。在转基因动物中，带有LCR结构域的基因都能高效表达，Felsenfeld(1996)等，用DNA重组技术证明鼠LCR是很强的增强子。 2．隔离子

基因表达有位置效应，有的活性基因变位到异染色质区附近时会失活。能防止处于阻抑状态与活化状态的染色质结构域之间的结构特点向两侧扩展的染色质DNA序列，称为隔离子(insulator)。研究表明，隔离子可能有下列作用：一是作为异染色质定向形成的起始位点；二是作为结构域两端的锚定点，提供拓扑隔离区，使结构域外的增强子成分不能进入；三是涉及追踪机制，远端增强子处组成的复合体沿染色质模板运动直到启动子，而隔离子可使这个复合体越轨。虽然三种作用模式均不能满意地解释所有观察到的隔离子现象，但却有可能证明隔离子是以不同方式行使功能的。果蝇中SCS(specialized chro— mosome structure)是一段250～ 300 bp的DNA序列，插入启动子与增强子之精品文档

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间可阻断来自增强子的转录激活作用。如当小白眼报告基因整合进果蝇基因组时，这个基因可免于产生位置效应。 (三)染色质模板的转录

真核细胞中基因转录的模板是染色质而不是裸露的DNA，因此染色质呈疏松或紧密结构，即是否处于活化状态是决定RNA聚合酶能否有效行使转录功能的关键。现在普遍认为，转录起始伴随着染色质上的一基因调节序列内部或者周围的结构改变。某些情况下，如在两栖类卵子发生过程中，rRNA基因 图8—33 通过核小体核心结构的转

进行活跃地转录时，染色质DNA似乎没有核小体。不过，研究大多数转录基因发现，仍然保留了它们的核小体，即使有RNA聚合酶沿着DNA运动也是如此。 RNA聚合酶是一个大分子，差不多有两个核小体那么大，它和大约50 bp DNA结合，而且还不能有损伤。因此DNA模板不太可能牢固地结合在未解开的核小体的核心结构上而被转录。RNA聚合酶被认为是用“核小体犁”(nucleosome plow)(如前面提到的SWI／SNF复合物)来克服这一障碍的，即用“核小体犁”来解除组蛋白和DNA间的相互作用。图8—33给出了一种模式，描绘了转录时核小体是如何解体的。 第六节 核基质与核体

在真核细胞的核内除染色质、核膜与核仁外，还有一个以蛋白质成分为主的网架结构体系，这一网架结构体系最初由Coffey和Berezney等人(1974)从大鼠肝细胞核中分离出来。他们用核酸酶(DNase和RNase)与高盐溶液对细胞核进行处理，将DNA、组蛋白和RNA抽提后发现核内仍残留有纤维蛋白的网架结构，并将其称之为核基质(nuclear matrix)。因为它的基本形态与胞质骨架很相似，又与胞质骨架体系有一定的联系，因此有人称之为核骨架(nuclear skeleton)。近年来，核骨架的研究取得了很大进展，已成为细胞生物学研究的一个前沿领域。目前，对核骨架可以有两种理解：广义的概念，核骨架应包括核基质、核纤层(或核纤层—核孔复合体结构体系)，以及染色体骨架

(chromosome scaffold)。另一种狭义的概念仅把核骨架具体理解为核基质。我们这里明确提出的核基质就是指在细胞核内，除了核被膜、核纤层、染色质与核仁以外的网架结构体系。从这一理解出发核骨架与核基质具有等同含义。 迄今为止，对核骨架的研究认识大致可归纳为： (1)核骨架是存在于真核细胞核内真实的结构体系。

(2)核骨架与核纤层、中间纤维相互连接形成的网络体系，是贯穿于核与质的一个结构系统。

(3)核骨架的主要成分是由非组蛋白的纤维蛋白构成的，含有多种蛋白成分。少量RNA的存在可能对维持核骨架结构的完整性是必要的。

(4)核骨架与DNA复制、基因表达及染色体的包装与构建有密切关系。 有关核基质的详细知识请阅读第十章细胞骨架的叙述。

二、 三、核体

高等真核细胞的间期核内除染色质与核仁结构外，最近几年在染色质之间 的空间还发现含许多形态上不同的亚核结构域(subnuclear domain)，统称为核体 (nuclear bodies，NBs)。在细胞的各种事件中，核体可能代表不同核组分的储存或查封位点或称之为分子货仓(molecular warehouse)。综合近年来的精品文档

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研究，首先，电镜超微结构研究已区分出几种不同类型的核体，其中有两种主要亚型：螺旋体(coiled bodies，CBs)和早幼粒细胞白血病蛋白体

(promyelocytic leukaemia proteinbodies，PML bodies)。由于螺旋体和PML体都与遗传疾病相关，所以 CBs和PML体的研究倍受关注。

螺旋体结构已在植物和动物的不同物种的间期核中被识别，其典型结构表现为直径约0．5m，呈螺旋状缠结的电子致密的纤丝结构。螺旋体的分子组分鉴定工作始于20世纪90年代，所报道的在螺旋体区域富集的各种组分的数目不断迅速增长，迄今已有30余种，包括各种核内小核糖核蛋白质(snRNP)、核和细胞周期控制蛋白，以及几种基本转录因子。其中p80 coilin蛋白是免疫电镜研究的标志蛋白(signature protein)，含有典型的NLSs和大量丝氨酸磷酸化位点。最近证实，coilin不仅能高亲和地结合polyr(G)同聚体和单链DNA，而且也能与 U7snRNP形成复合体。应用标记的UTP为前体的脉冲标记实验证实，螺旋体的功能涉及snRNP的生物发生(biogenesis)。进一步研究发现，CBs是一种具有多功能的细胞器，在指导核内snRNA分选中起主要作用，而且可能是snRNP和小核仁核糖核蛋白(snoRNP)的生物合成途径中的义务站点。还发现CBs与 snRNA和组蛋白基因结合，还能同时与多个染色体基因座相互作用，因此推测 CBs在基因表达协调反馈调节中也起作用。

早幼粒细胞白血病蛋白体在形态上与CBs不同，为环形和其他简单的核体组成一类亚结构，直径约0．5m，围绕一个不含PML的核心组成一个含有 PML的密结环。已发现含有20多种不同组分，其标志蛋白是早幼粒细胞白血病蛋白(PML蛋白)。PML体也是一种多功能细胞器，其功能不仅涉及转录调节的许多方面，而且是病毒感染的靶结构。此外近年来研究发现，PML体组成的改变与某些疾病表型的发生有关。在急性早幼粒细胞白血病(APL)病人中，发现PML体的破坏是APL病因学的共同特征。这种病人携带一种频发易位 (t15；17：q22；q21)，这种易位涉及编码早幼粒细胞白血病蛋白(PML)和视黄酸受体。(RNRa)的基因，易位基因产生一种融合蛋白，这种PML—RNRa融合蛋白不仅不能定位在源于病人细胞系的PML体内，而且对野生型PML的定位也有显著的影响，其作用是阻断野生型PML的作用，赋予APL细胞的存活优势和导致白血病。现有研究表明，PML蛋白的功能可能是作为负生长调节子(negative

growth regulon)和肿瘤抑制子而发挥作用。最近，基因剔除(gene knockout)研究发现，Pml—／—小鼠可存活，但对肿瘤和病毒更为易感。进一步的研究还发现PML的一个作用可能是介导程序性细胞死亡。用许多外源性的细胞信号包括细胞因子和射线处理细胞和细胞系，导致PML的上升调节(upregulation)，即增加PMI。体的大小和引起细胞凋亡，而PML—RNRa融合蛋白则抑制 PML的下游作用，阻断细胞凋亡和早幼粒细胞的分化。用视黄酸或砷化合物处 理引起融合蛋白降解并缓解阻断作用。此外，还发现PML体在细胞周期中起作用。

提要

细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞器，是细胞遗传与代谢的中心。细胞核主要由核被膜(包括核孔复合体)、染色质、核仁及核骨架组成。核被膜与核孔复合体是真核细胞所特有的结构，核被膜作为细胞核与细胞质之间精品文档

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的界膜，将细胞分成核与质两大结构与功能区域，从而使转录与翻译这两个基因表达的基本过程在时空上分开。在细胞周期中，核被膜经历有规律地解体与重建。与核膜相连系的核孔复合体是一种复杂的跨膜运输蛋白复合体，核孔复合体主要由胞质环、核质环、辐和栓4种结构亚单位组成，在核质面与胞质面呈不对称性分布，构成核质交换的双向选择性亲水通道，核质之间主要通过核孔复合体实现频繁的物质交换与信息交流。

染色质是间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的线性复合结构。构成染色质的DNA包括B型、A型和Z型三种构型，不同构型的 DNA其大沟和小沟的特征在遗传信息的表达中起关键作用。真核细胞染色质 DNA序列的组织性复杂，包括单一序列、中度重复序列和高度重复序列。构成染色质的蛋白负责DNA遗传信息的组织、复制和阅读。其中组蛋白是基本结构蛋白，与DNA非特异性结合；非组蛋白是序列特异性DNA结合蛋白，是重要的基因蛋白，它们具有不同的结构模式，形成不同的DNA结合蛋白家族。

20世纪70年代发现，核小体是构成染色质的基本结构单位，每个核小体由组蛋白八聚体核心及200 bp左右的DNA和一分子组蛋白H1组成。 间期染色质按其形态表现、染色和生化特点，可分为常染色质与异染色质两类，异染色质又分为结构异染色质和兼性异染色质。处于常染色质状态只是基因转录的必要条件而非充分条件，因此，按其功能状态又将染色质分为活性染色质和非活性染色质。在真核细胞，染色质的结构与基因表达有密切关系。主要问题有三个方面：一是如何形成活性染色质中的超敏感结构以便RNA聚合酶能起始转录；二是具有转录活性的染色质结构域如何与周围的非活性区域隔离；三是RNA聚合酶如何通过与组蛋白结合的DNA模板进行转录。

染色体是细胞有丝时遗传物质存在的特殊形式，是间期染色质紧密包装的结果。中期染色体具有比较稳定的形态。在细胞世代中确保染色体的复制和稳定遗传，染色体起码具备三种功能元件：一个DNA复制起点，一个着丝粒和两个端粒。细胞染色体组在有丝中期的表型称为核型，核型具有物种特异性。用特殊染色技术可使染色体显示特殊的带型，从而提示染色体带作为更大范围的结构域对细胞的功能可能是重要的。此外，在某些生物的细胞中，特别是在发育的某些阶段，可以观察到特殊的巨大染色体，包括多线染色体和灯刷染色体。

核仁是真核细胞间期核中最显著的结构，其形态、大小随细胞类型和细胞代谢状态不同而变化。核仁普遍存在三种基本组分：纤维中心(FC)、致密·纤维组分(DFC)和颗粒组分(GC)。新近比较一致的看法认为，FCs是rRNA基因的储存位点，转录主要发生在FC与DFC的交界处，初始rRNA转录物首先出现在 DFC并在那里加工；某些加工步骤也发生在颗粒组分区(GC)，并负责将rRNA与核糖体蛋白装配成核糖体亚单位，所以GC代表核糖体亚单位成熟和储存的位点。核仁的主要功能涉及核糖体的生物发生，这是一个向量过程。该过程包括rRNA的合成、加工和核糖体亚单位的装配。在细胞周期中，核仁是一种高度动态的结构，在有丝过程中表现出周期性的解体与重建。间期核核仁结构整合性的维持和有丝后期核仁的重建，都需要rRNA基因的活性。 精品文档

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在真核细胞的核内除染色质、核膜与核仁外，还有一个以蛋白质成分为主的网架结构体系，即核基质，这一结构体系与DNA复制、基因表达和染色体包装与构建有密切关系。

高等真核细胞的间期核内除染色质与核仁结构外，新近发现染色质之间的空间还含有许多形态上不同的亚核结构域，统称为核体。在细胞的各种事件中，核体可能代表不同核组分的分子货仓。思 考 题 1．概述细胞核的基本结构及其主要功能。 2．试述核孔复合体的结构及其功能。 3．概述染色质的类型及其特征。 4．比较组蛋白与非组蛋白的特点及其作用。 5．试述核小体的结构要点及其实验证据。 6．试述从DNA到染色体的包装过程。 7．分析中期染色体的三种功能元件及其作用 8．概述核仁的结构及其功能。 9．概述活性染色质的主要特点。 10．试述染色质结构与基因转录的关系。 11．自行选择重要名词并进行解释。参考文献

1．Gerald Karp．Cell and Molecular Biology：concepts and experiments，2nd ed．New York： John Wiley＆Sons lnc·，1999 2．Bruce Alberts fJ O／．Molecular Biology Of the Cell，3rd ed．New York＆London：Gar— land Publishing lnc·，1994

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