1、 固定液固定(固定液体积是固定材料的十倍以上)
3%戊二醛 in 0.1M PBS ,ph7.2,室温5-6h,后4°C保存
(取材:先整个材料放入固定液中,之后用锋利的双面刀片分割,不能撕扯材料,分割成小块后1*1mm,置于固定液中,抽气~20min,让材料沉入固定液中)
2、 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次,20-30Min/次
3、 1%锇酸固定 in 0.1M PBS,4°C overnight
4、 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次,20-30Min/次
5、 乙醇系列脱水:30%-50%-70%(4°C, overnight,可以停下-80%-90%-95%-100%-100%(每级20-30分钟,不同材料时间不同)
注意:100%乙醇时不要吸干,防止材料干了。
用丙酮置换乙醇:
乙醇:丙酮=1:1,纯丙酮2次, 每级20-30分钟
6、 丙酮:树脂=2:1, 1:1(可以停下了,overnight) ,1:2 2-3h/级
纯树脂12h,
)
换纯树脂12h (从进入树脂开始就要防潮!)
7、 包埋
8、 聚合60°C 24hr
注意:免疫电镜时不用锇酸固定,树脂换成LRWhite等水溶性树脂,固定液可以是25%戊二醛+1.25%多聚甲醛 in 0.1M PBS Ph 7.2