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第１３卷第３期 北京农学院学报 Ｖｏ１．１ ３ Ｎｏ．３ １９９８年７月 ＪＯＵＲＮＡＬ ０Ｆ ＢＥＵＩＮＧ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ Ｃ０ＬＬＥＧＥ Ｊｕ１． １ ９９８ ７ 物样 品中 游离氨基酸总量测定方法的改进 王文平 （北京农学院农学系，北京１０２２０６） 殴ｆ，７． 八Ｕ ｏ Ｎ ／／＼ ．ｒ＿＿ｖ 摘要本文根据氨基酸与茚三酮显色反应的原理，对传统测定植物鲜样游离氨基酸总量 的方法作了改进．用沸水浴处理植物样品提取液可 破坏样品中抗坏血酸，使得样品提取液 与制作氨基酸标准曲绒反应液的抗坏血酸完全控制在同一水平上，避免了样品与标准曲线 反应液由于抗坏血酸含量不同造成的误差．另外适当提高反应体系抗坏血酸的浓度可以提 高反应的灵敏度． ＼ ／ ／ ●＼ 广＿ｖ＆ ｏ ／／＼ Ｈ 氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物．植物根系吸收、同化的氨素 主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输，所以测定植物组织中不同时期、不同部位游离氨基酸 的含量，对于研究根系生理、氮素代谢等有一定的意义． 反应原理 氨基酸总量测 定采用茚三酮溶藏显色法，它的反应式如下 ／ 一／Ｏ Ｈ 一 Ｉ Ｉ Ｉ／ＯＦＩ 、／、ｌ／＼ｏ｝｛ ＩＩ …ｍ彻 Ｏ ｎ ０ ／＼——／ 一 Ｏ Ｎ一＼——／＼ ０” ｌＩ ＩＩ ／Ｊ圳 。 二酮茚一二酮茚胺的取代盐 （蓝紫色物质） 收稿日期：ｌ９９８—０ｌ一。８ ＊北京市自然科学基叠赍助 维普资讯 http://www.cqvip.com
１０ 北京农学院学报 第ｌ３卷 氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，能产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化 合物，在一定范围内，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比．用分光光度计在５８０ ｎｌＴ４下测定 反应产物的消光值．根据标准曲线计算出未知样品中氨基酸的总量． ２存在的问题 在实验教学中，几乎所有公开发行的实验教材上给出的实验方法如下 。 ： １）标准曲线制作．２）样品提取：取鲜豆芽０ ５ ｇ加５ ｍｌ１Ｏ 醋酸研磨，用ｐＨ５．４，０．２Ｍ 醋酸盐缓冲液稀释至１０Ｏ ｍ１，过滤，得滤液后按下部标准曲线一起操作．３）测定ｔ标准曲线 与样品显色，按表１加药： 表１传统测定氨基酸总量的药品加样量 ０ ０ ｉ． ． ． Ｏ 项目 标准亮氪醴（ｒ【ｌ１） Ｏ Ｏ ｌ ＿ ３． ０ ． １ 样品提取液（ｍ１） Ｏ Ｚ ｐＨ５．４缓冲液（ｍ１） ０ ｌ ． ３． Ｏ ． 术舍茚三酮（ｒｏＤ ０ １ 抗坏血醴（ｒ【ｌ１） 含氟量（ ） 上述９支试管在沸水中煮１５ｒａｉｎ，然后迅速在冷水中冷却，摇匀，稀释到２Ｏ ｍ１．在５８０ ｎｒｉｉ 下测定Ｏ．Ｄ值．以每毫升含氮的微克数为横坐标，Ｏ．Ｄ值为纵坐标绘制标准曲线，样品值可 Ｌ Ｏ Ｌ ｍ ５ 从标准曲线中读出含氮量 ４）计算：结果用每１００ ｇ鲜重所含氨态氮的微克数报告．。 １Ｏ多年的实验教学中发现，用上述的实验方法教学往往会出现很多的问题，这些问题是 Ⅲ 枷 ①标准曲线的显色反应不稳定，很难成一条直线，而且还经常出现无显色反应．②在样品测 定中植物材料是鲜活的植物组织，含有大量的抗坏血酸，使得测定系统中标准曲线与样品的 蛐 抗坏血酸含量出现很大的差别．⑧植物鲜活的组织中还含有可溶性的蛋白质，这些水溶性的 蛋白质也可与茚三酮呈显色反应．因此根据这个测定程序得出的结果常常与在氨基酸分析仪 中测定值相差甚远，一般趋势是样品氨基酸总量比实际值偏高很多 ３解决方法 ３ １样品处理 先把提取出的植物样品在１００℃沸水浴中反应１ ５ｍｉｎ，目的有两个 一是破坏鲜活植物组 织中的抗坏血酸，使它氧化；二是沉淀鲜活植物组织中可溶性的蛋白质，减少蛋白质含量对 氨基酸测定的干扰． ３ ２适当增加反应体系中抗坏血酸的量 抗坏血酸浓度由原来的０．１ 增加到０ ３ 这是因为氨基酸与水台茚三酮的反应分两 维普资讯 http://www.cqvip.com
１ ９９８年第３期 王文平：植物样品中游离氨基酸总量测定方法的改进 ｌ１ 步进行．首先氨基酸脱氨脱羧被氧化，水台茚三酮被还原．接着，氧化型和还原型的水台茚 三酮与氨反应生成二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化台物．在此实验中，抗坏血酸是个 还原剂，如果茚三酮反应中还原型的氨基酸量不够，就不能充分反应，呈现的颜色浅或不显 色．只有适当增加抗坏血酸的量才能使反应充分进行． 。５ ¨ 帅 ５ ４ ５ ３ ５ ２ ５ １ ５ Ｏ ４改进结果 １）两种方法标准曲线的比较在传统的作法中，实验结果较好的数据标准曲线如图１，改 进操作方法后，实验的数据标准曲线如图２。 ＯＤ 氢基酸标准曲线 Ｌ．Ｌ ＯＤ 氨基酸标准曲线 ０．９ ０．８ ０．７ ０．６ ０．５ ０．４ ０．３ ０．２ ０．１ 量 ｇ ０ 含氮量Ｉ．ｔ ｇ 图１氪基酸标准曲线 囝２氪基酸标准曲线 ２）改进后的实验方法实验方法经过这样的改进，解决了传统方法中带来的许多问题， 更能真实地反映植物鲜活组织中游离氨基酸的含量，也使我们的实验教学更加具有真实性和 科学性．因此我们认为在做游离氨基酸总量的测定中，应当按以下实验步骤进行． （１）目的：氨基酸是蛋白质的基本单位，测定植物体不同部位游离氨基酸含量对于研究 根系生理氮素代谢有一定意义． （２）原理：当氨基酸与水舍茚三酮作用后产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合 物，在一定范围内颜色的深浅与氨基酸的含量成正比． （３）仪器、试剂 仪器：①试管２Ｏ ｍＩ×１０支；②研钵１个；③离心机１台（配离心管）；④容量瓶２５ ｍｌ×ｌ’ ⑤刻度穆液管１０ｍｌ×２，２ｍｌ×２，０．５ｍｉｘ１；⑥７２１分光光度计１台；⑦水浴锅１个；⑧托 盘扭力天平１个． 试剂：①水合茚三酮试剂：取０．６ ｇ茚三酮置于烧杯中，加ｌ ５ｍｌ正丙醇，令其溶解，再 加３０ｍｌ正丁醇，６０ｍ１乙二醇，最后加入９ｍｌ ｐＨ５．４，０．２Ｍ的醋酸盐缓冲液．②标准亮氨 酸：取亮氨酸４６．８ ｍｇ，溶于１０ 异丙醇溶液中，并用１０ 异丙醇定容为１００ ｍｌ（１０ 异丙 醇应以ｐＨ５．４，０．２ Ｍ醋酸盐缓冲液做溶剂配制）．取５ ｍｌ液，再用ｐＨ５．４醋酸盐缓冲液定 维普资讯 http://www.cqvip.com
１２ 北京农学院学报 第１３卷 容到５０ ｍ１，此即为含氮为５ ｍｇ／Ｌ的标准液．③０．３ 抗坏血酸溶液，现用现配． （４）操作步骤：①样品提取：取鲜豆芽０．５ ｇ加５ ｍｌ １０ 醋酸研磨，离心取上清液０．５ ｍｌ， 用ｐＨ５．４醋酸盐缓冲液，定容至２５ ｍｌ－②测定：先取制备好的样品提取液１０ ｍｌ，加入２０ ｍ１ 试管中，在水溶锅中沸水煮１５ ｍｉｎ，目的是沉淀样品中的蛋白质和氧化抗坏血酸．然后冷却 备用，测定时与标准曲线溶液一块显色．按表２分别加入试剂： 表２改进后测定螽基酸总量的方法中试剂加样量 Ｃ一 上述９支试管在沸水中煮１ ５ ｍｉｎ，然后在冷水中冷却、摇匀，稀释到２０ ｍｌ＿在５８０ ｎｍ下 测定Ｏ．Ｄ值，绘制标准曲线，样品可从标准曲线读出含氮量．一品 （５）计算：结果用每１００ ｇ鲜重所含氨态氨的毫克数报告．× 体ｌ堕用ｌ煎比百 整鱼× 蛙一∞ 宝 氨基态氨（ｍｇ／］００ ｇ鲜样品） ×１００ 式中：Ｃ为由标准曲线查得每毫升样品中氨基态氮的微克数 塑 致谢本文得到花宝光老，ｆ指导，谨此致谢！ 参考文献 １ 饪沛洪等．基础生物化学实验指导．陕西：陕西科学技术出版社，１９８８ ２张云贵等．生物化学实验指导．天津：天津大学出版社．１９９３ 维普资讯 http://www.cqvip.com
１９９８年第３期 王文平：植物样品中游离氨基酸总量测定方法的改进 １ ３ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ｉｎ Ｆｒｅｓｈ Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｗａｎｇ Ｗｅｎｐｉｎｇ （Ｂｅｉｊｌｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０２２０６） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｐａｐｅｒ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒ￣ｎｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎ ｆｒｅｓｈ ｐｉａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｗａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｓｅｏｒｂｉｅ ａｃｉｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｃ０ｒｂＩｃ ａｃｉｄ ｗｈｉｃｈ ｗｉｌｄｌｙ ｅｘｉｓｔｓ ｉｎ ｆｒｅｓｈ ｐｌａｎｔ ｔｉｓ— ｓｕｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｈａｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ｅＬｔｒｖｅ，ｔｈａｔ ａｌ－ ｗａｙｓ ｍａｄｅ ｓｏｍｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎａ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｓｔｏｙ ａｓｅｏｒｂｉｒｅ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｒｅｓｈ ｐｉａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ，ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ｂｏｉｌｅｄ ｆｏｒ １ ５ ｒａｉｎ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｔａｒｔｅｄ．Ｏｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｈａｎｄ，ｉｎｅｒｅａｓｅｄ ａａｅｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｒ０１１１－ ０．１ ｔＯ ０．３ ，ｗｈｋｈ ｖ／ａｓ ａｄｄｅｄ ０．１ｍｌｉｎ ｅｖｅｒｙｔｕｂｅ ｏｆｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｃａｎｍａｋｅｔｈｅ ｒｅ－ ａｃｔｉｏｎ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，ａｓｅｏｒｂｉｅ ａｃｉｄ，ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ，ｍｅｔｈｏｄ ｉｍｐｒｏｖｅ
