效应面法优化蒙花苷水解工艺及其水解物的醛糖还原酶抑制活性研究

效应面法优化蒙花苷水解工艺及其水解物的醛糖还原酶抑制活性研究

作者：王娇 许浚 张铁军

来源：《中国中药杂志》2014年第11期

[摘要] 目的：用效应面法对蒙花苷的水解工艺进行优化，通过醛糖还原酶模型研究其水解物金合欢素醛糖还原酶的抑制活性。方法：建立水解物金合欢素体外生物酶模型，通过测定NADPH的荧光吸收，计算水解物金合欢素对醛糖还原酶的抑制率，从而得到水解物的醛糖还原酶抑制活性的IC50的平均值。在蒙花苷水解工艺中采用效应面法优化水解工艺，并对结果进行预测分析。结果：水解物金合欢素醛糖还原酶抑制活性，其IC50的平均值为2.74 mg·L-1。优选的水解工艺为水解时间7.4 h，硫酸甲醇0.54 mol·L-1，固液比3∶1。结论：水解物金合欢素具有比蒙花苷较好的醛糖还原酶抑制活性。优选的蒙花苷水解工艺简便，预测性良好。 [关键词] 蒙花苷；效应面分析法；金合欢素；醛糖还原酶抑制剂 [收稿日期] 2013-12-09

[通信作者] 张铁军，Tel：（022）23006848，E-mail：tiezhang4@sina.com [作者简介] 王娇，硕士研究生，Tel：（022）23006843，E-mail：taoqibaojiaojiao369@aliyun.com

糖尿病慢性并发症是严重影响患者生命质量的全身性病变，糖尿病视网膜病变是发病率较高的一种糖尿病慢性并发症。醛糖还原酶抑制剂是通过抑制醛糖还原酶的活性，间接抑制多元醇通路的一类延缓和阻断糖尿病并发症的药物[1-2]。近年来从植物提取出的具有抑制醛糖还原酶活性的化合物主要有黄酮类化合物。

蒙花苷为菊科植物野菊花Chrysanthemum indicum L.的主要天然黄酮类成分[3]。近年来国内外研究表明，蒙花苷对大鼠晶状体的醛糖还原酶（AR）有抑制活性[4]。本实验室前期研究表明，蒙花苷属于低溶解度，透过性较差的药物[5]。药物比表面积和脂溶性对药物体内吸收有重要的促进作用，因此通过去糖基化增加蒙花苷的比表面积和脂溶性，对蒙花苷进行结构修饰。效应面法具有试验次数少，精确度高，应用方便的特点，该设计方法可以很好地应用于药学领域[6]。本研究以蒙花苷水解率为指标，运用效应面法进行蒙花苷水解工艺优化。选用经典的非细胞模型[7-9]，评价醛糖还原酶在水解物金合欢素干预下的变化。 1 材料

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Lab Alliance高效液相色谱仪（SeriesⅡ一元泵系统，Lab Alliance色谱工作站）；AB204-N电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；HS-3120超声波清洗器（奥特赛恩斯机器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪高科仪器厂）。

蒙花苷对照品（实验室自制，经HPLC归一法检测纯度>97%），金合欢素（中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱醇，天津市康科德科技有限公司）；冰醋酸（色谱醇，天津市康科德科技有限公司）；其他试剂均为分析醇。

Wister大鼠，雄性，天津市山川红实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（津）2009-0001。 2 方法与结果 2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件 流动相乙腈-水-冰醋酸（40∶59∶1）；体积流量1 mL·min-1；检测波长326 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃。

2.1.2 标准曲线的绘制 分别精密称取蒙花苷和金合欢素对照品5.35，11.00 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，作为蒙花苷对照品储备液和金合欢素对照品储备液。采用逐级稀释法用甲醇配置成不同浓度的蒙花苷对照品溶液和金合欢素对照品溶液，摇匀，按照2.1.1项下色谱条件进行测定，记录蒙花苷色谱峰面积及金合欢素色谱峰面积。以蒙花苷对照品溶液质量浓度为横坐标（XL），峰面积积分值为纵坐标（YL）进行线性回归，得回归方程为YL=7XL-373.742，R2=0.999 2，线性范围0.1～52.9 mg·L-1；以金合欢素对照品溶液质量浓度为横坐标（XA），峰面积积分值为纵坐标（YA）进行线性回归，得回归方程为YA=7XA-4 828.128，R2=0.999 0，线性范围2.2～110.0 mg·L-1。

2.1.3 水解率的计算 蒙花苷水解率=金合欢素峰面积/（金合欢素峰面积+蒙花苷峰面积）×100%。

2.2 单因素试验设计

2.2.1 水解时间 称取6份蒙花苷，按固液比1∶1，加入相应0.45 mol·L-1硫酸甲醇，搅拌加热，水解温度95 ℃，水解时间分别设为4，5，6，7，8，9 h，放冷，取上清液测定蒙花苷水解率，结果见图1，可知最适水解时间为7 h。

2.2.2 酸浓度 称取6份蒙花苷，按固液比1∶1，分别加入0.15，0.3，0.45，0.6，0.75 mol·L-1硫酸甲醇，搅拌加热，水解温度95 ℃，水解时间7 h，放冷，取上清液测蒙花苷水解率，结果见图2，可知最适酸浓度0.45 mol·L-1。

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2.2.3 固液比 称取6份蒙花苷，分别按固液比1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，加入相应0.45 mol·L-1硫酸甲醇，搅拌加热，水解温度95 ℃，水解时间7 h，放冷，取上清液测蒙花苷水解率，结果见图3，可知最适物料比3∶1。 2.3 效应面试验设计

2.3.1 试验设计 根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理[8]，结合单因素实验结果，选择对蒙花苷水解反应影响较大的酸浓度（X1）、固液比（X2）、水解时间（X3）3个因素作为考察因素，以水解率为响应值，采用3因素3水平的响应面实验设计，见表1。

2.3.2 效应面试验结果及数据分析 多元二次模型方程的建立与检验：各试验点根据设计进行15次试验，以水解率Y为响应值，试验点设计及试验结果见表2。

采用Design-Expert 7.1.6软件对表2中实验数据进行多元回归拟合，得到蒙花苷水解的回归方程：Y=0.91+0.15X1+0.013X2+0.23X3-0.037X1X2-0.16X1X3+0.027X2X3-0.098X12-0.056X22-0.16X32。

对该模型进行方差分析，结果见表3。结果显示所选用的二次回归模型具有高度的显著性（P

效应面分析及优化：利用Design-Expert7.1.6软件对回归分析结果作相应的曲面图，见图4。根据Box-Behnken实验所得结果及二次多项回归方程，利用Design Expert软件中的数据优化（numerical optimization）程序求得各因素最佳范围分别为水解时间6.8～7.6 h，硫酸甲醇0.48～0.56 mol·L-1，固液比2.8∶1～3.1∶1。 2.4 验证性试验

依据二次多项回归方程，选取的最佳水解条件为水解时间7.4 h、硫酸甲醇0.54 mol·L-1、固液比3∶1，预测最优水解率79.%。为了验证优化结果的可靠性，在最佳水解条件下进行了3组试验，测得蒙花苷平均水解率为78.97%，RSD 0.90%，与预测值（79.%）的偏差为0.8%，说明本实验建立的数学模型工艺稳定，重复性好，可见该模型能较好地预测实际水解情况。

2.5 水解物金合欢素对醛糖还原酶抑制活性研究

2.5.1 醛糖还原酶的提取 Wistar大鼠颈椎脱臼处死，立即摘除眼球，分离晶状体（冰上进行）放入20 mL 10 mmol·L-1β-巯基乙醇[含有135 mmmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）]中，匀浆，4 ℃离心30 min，取上清液，-20 ℃保存。

2.5.2 反应体系的建立 设立阳性对照组和阴性对照组，每组4个复孔。反应体系中加入180 mmmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）225 μL，1.0 mmol·L-1硫酸锂溶液50 μL，10 mmmol·L-1

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DL-甘油醛溶液50 μL，阳性对照溶液（提取的酶溶液100 μL），阴性对照组加去离子水100 μL混合，30 ℃预热3 min，加入0.3 mmol·L-1 NADPH溶液50 μL，30 ℃反应30 min，加入0.5 mmol·L-1盐酸150 μL终止反应，各测试管分别加入10 mmmol·L-1咪唑（含6 mmol·L-1氢氧化钠溶液）10 μL，60 ℃反应20 min，室温放冷后于激发波长360 nm ，吸收波长460 nm检测荧光吸收度，见图5，阴性对照为NADPH在此反应体系中自身氧化变化趋势，阳性对照组中NADPH的荧光强度显著降低，说明AR的活性较强。

2.5.3 标准曲线的绘制 180 mmmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）2 450 μL，1.0 mmol·L-1硫酸锂溶液700 μL，10 mmmol·L-1 DL-甘油醛溶液700 μL，二甲基亚砜（DMSO）350 μL，提取的酶溶液1 400 μL和0.5 mmol·L-1的盐酸2 100 μL混合后取出600 μL，分别加入NADP溶液0，1，2，4，8，16 μmmol·L-1，各测试管分别加入10 mmmol·L-1咪唑（含6 mmol·L-1氢氧化钠溶液），60 ℃反应20 min，室温放冷后于激发波长360 nm，吸收波长460 nm检测荧光吸收度。以NADP溶液浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程A=13.195C+57.062（r=0.998 9），线性范围为0～18 μmmol·L-1。

2.5.4 样品溶液的配置 180 mmmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）采用倍比稀释法分别将蒙花苷和金合欢素的DMSO溶液稀释成一定浓度，溶液在终浓度时所含DMSO体积相等且小于2.5%。

2.5.5 筛选方法 按表5设置反应组，每个反应组中均加入提取的酶溶液50 μL，1.0 mmol·L-1

硫酸锂溶液100 μL，180 mmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）225 μL。

2.5.6 实验结果 按照下式计算有效组分各浓度的抑制率。据各浓度的抑制率应用Origin Pro4.0软件计算出IC50。抑制率=（A-B）/（A-C）×100%，式中，A为阴性对照组吸收度，B为样品组吸收度，C为空白组吸收度。由此计算的蒙花苷醛糖还原酶抑制活性的IC50的平均值为3.53 mg·L-1，金合欢素醛糖还原酶抑制活性的IC50的平均值为2.74 mg·L-1。 3 讨论

中医药治疗糖尿病并发症所使用的天然药物毒副作用小，价廉易得，适合作为终身病的糖尿病患者服用。已有报道称蒙花苷有较好的醛糖还原酶作用，但蒙花苷的溶解度小，生物利用度低，所以，改变蒙花苷的构型是增加其生物利用率的一个重要途径。本研究从大鼠晶状体中提取醛糖还原酶，建立了体外测定醛糖还原酶活性的反应体系，并观察了蒙花苷和其水解物金合欢素对大鼠晶状体醛糖还原酶活性的影响结果蒙花苷醛糖还原酶抑制活性的IC50的平均值为3.53 mg·L-1，证明蒙花苷具有较强的醛糖还原酶抑制作用，并且，经本实验优化的蒙花苷水解工艺后，生成的水解物金合欢素（金合欢素醛糖还原酶抑制活性的IC50的平均值为2.74 mg·L-1

）具有相似甚至为更好的醛糖还原酶抑制活性。通过水解蒙花苷脱糖基的工艺研究，使其从

黄酮苷转换成具有相似活性成分苷元，提高亲脂、亲油性，增加其生理活性，方便人体更好的吸收利用。

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传统的数理统计常通过正交设计或均匀设计寻求最佳的因素水平组合。但其中存在一些问题，如试验的精度不够，选择的试验取值仅仅是接近最佳取值，无法精确找到最佳点，条件优选凭经验，不能灵敏地考察各因素间的交互作用等等。而响应面分析法是通过中心组合试验研究几种因素间相互作用的一种回归分析方法，可从图形方面分析寻求最优的考察因素和响应值[10-12]。本实验对蒙花苷水解工艺条件进行了单因素和效应面优化实验。结果显示，水解时间和硫酸浓度对水解率的影响极其显著，影响作用按主次顺序排列为水解时间>硫酸浓度>固液比。确定最佳水解条件为时间7.4 h、硫酸甲醇0.54 mol·L-1、固液比3∶1，在此条件下，蒙花苷78.97%以上转化为金合欢素。 [参考文献]

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Optimization of hydrolysis process of linarin using response surface methodology and research about ARI activity of glycosylation-acacetin WANG Jiao， XU Jun， ZHANG Tie-jun

（1.Tianjin Medical University， Tianjin 300070， China；

2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research， Tianjin Engineering Laboratory of Quality Control Technology of

Traditional Chinese Medicine， National Local United Engineering Laboratory of Modern Preparation and

Quality Control Technology of Traditional Chinese Medicine （Tianjin）， State Key Laboratory of Drug Delivery

Technology and Pharmacokinetics， Tianjin 300193， China）

[Abstract] Objective： To optimize the hydrolysis process of linarin by response surface methodology， and to use the model of aldose reductase to study the acacetin′s activity of aldose reductase inhibitory. Method： The model of acacetin enzyme in vitro was established by the determination of fluorescence absorption of NADPH， the inhibition rate of acacetin aldose reductase was calculated， and then the IC50 of hydrolysis was obtained. The hydrolysis process of linarin hydrolysis condition was optimized by using response surface method. Result： The results indicated that the IC50of acacetin （2.74 mg·L-1） was less than the IC50of linarin （3.53 mg·L-1）.

Hydrolyzation time of 7.4 h， sulphuric acid concentration of 0.54 mol·L-1 and the ratio of material to liquid of 3∶1 were the optimum conditions. Conclusion： Hydrolyzate acacetin has preferable

inhibitory activity of aldose reductase. The optimized hydrolysis condition of linarin is convenient to use with good predictability.

[Key words] linarin； response surface methodology； acacetin； aldose reductase inhibitor

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doi：10.4268/cjcmm20141123 [责任编辑 马超一]

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