北京索莱宝科技有限公司氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。货号：BC1185规格：100T/96S产品内容：试剂一：液体100ml×1瓶，4℃保存。试剂二：液体130μl×1支，4℃保存。试剂三：液体20ml×1瓶，4℃保存。试剂四：液体2.5ml×1瓶，4℃保存。试剂五：粉剂1瓶，4℃保存，用前2.5ml蒸馏水溶解。溶解后-20℃分装保存。试剂六：液体12.5μl×1支，用前0.25ml蒸馏水稀释，4℃保存。标准品：粉剂10mg×1支，4℃避光保存。产品说明：氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又称为二硫代谷胱甘肽，是两分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG会被谷胱甘肽还原酶还原成GSH，因此机体中大多数是以还原型形式存在。测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。本试剂盒利用谷胱甘肽能和5，5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5，5’-dithiobis-2-nitrobenoicacid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸，2-硝基-5-巯基苯甲酸在波长412nm处具有最大光吸收的特点，通过2-乙烯吡啶抑制样品中原有的还原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶将GSSG还原为GSH，借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。自备仪器和用品：第1页，共4页北京索莱宝科技有限公司分析天平、微量匀浆器（规格2ml）、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计或酶标仪、微量玻璃比色皿或96孔板。操作步骤：一、样品的处理（1）组织处理新鲜组织首先用PBS冲洗2次，然后称取动物组织或者植物组织0.1g。加入用试剂一润洗过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入1ml试剂一（组织/试剂一比例保持不变即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；8000g4℃离心10min；取上清液放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。（2）血液处理血浆：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的试剂一，4℃，8000g离心10分钟，将上清移入新的试管中放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。血细胞：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，弃去上层血浆用3倍体积的PBS清洗3次（用PBS重悬血细胞，600g离心10分钟），加入等体积试剂一，混匀后4℃放置10分钟，8000g离心10分钟，吸取上清放于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。（3）细胞处理收集不少于10个细胞，首先用PBS清洗细胞2次（PBS重悬细胞，600g离心10分钟），加入3倍细胞沉淀体积的试剂一重悬细胞，反复冻融2-3次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解），8000g离心10分钟，收集上清于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。二、实验操作：第2页，共4页6
北京索莱宝科技有限公司1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计蒸馏水调零。2、试剂二放置37℃（哺乳动物）或25℃（一般物种）水浴中保温30min。3、标准品的稀释：将标准品用1ml蒸馏水溶解(4℃保存)，浓度为10mg/ml。取适当溶液配制浓度为25μg/ml、20μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、0μg/ml的标准品（试剂一十倍稀释后进行稀释）。4、取0.5ml离心管，加入20μL稀释好的标准品或样品，加入1μL试剂二，混匀后37℃孵育30分钟。5、制作标准曲线孵育完成后标准管依次加入140μL试剂三，20μL试剂四，20μL试剂五，2μL试剂六，迅速混匀后，测定412nm处30s和150s光吸收A1和A2。吸光度（A2-A1）为横坐标（x），浓度为纵坐标（y）做标准曲线。6、样品管依次加入140μL试剂三，20μL试剂四，20μL试剂五，2μL试剂六，迅速混匀后，测定412nm处30s和150s光吸收A1和A2，△A=A2-A1。三、GSSG含量计算根据标准曲线，将样品△A带入公式中（x），计算出样品浓度y（μg/ml）。（1）按蛋白浓度计算GSSG（μg/mgprot）=y×V样÷(V样×Cpr)=y÷Cpr（2）按样本质量计算GSSG（μg/g鲜重）=y×V样÷(V样÷V样总×W)=y÷W（3）按细胞数量计算GSSG（μg/10cell）=y×V样÷(V样÷V样总×细胞数量)=y÷细胞数量（4）按液体体积计算第3页，共4页4
北京索莱宝科技有限公司GSSG（μg/mL）=2yV样总：上清液总体积，1mL；W：样品质量，g；细胞数量，以10单位计量；6
V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；2：血浆（血细胞）稀释一倍。注意事项：1、样品处理需匀浆完全，若当天不能完成测量，可放-80℃保存。2、若不确定样品中GSSG含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。3、此方法利用酶促反应速率计算底物浓度，尽量准确在30秒和150秒处完成读数。4、因为试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。第4页，共4页
