蛋白印迹——western blot 实验流程及注意事项

各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 实验步骤

1. 配制分离胶5ml（配方见图1）；

2. 将液体用1ml移液器加入玻璃板（从玻璃板的边缘加入，速度适中，尽量不要产生气泡）； 3. 用去离子水压胶（利用重力作用把胶压平，否则如果有气泡，胶就不平了，影响电泳效果。注意上面盖一保鲜膜，防止液体挥发）； 4. 大约1小时后（也可以第一天晚上配好分离胶过夜，第二天一早配制堆积胶），配制堆积胶1ml。 5. 倒掉玻璃板上面的水并用滤纸吸干，加入堆积胶，并插入梳子； 6. 约1小时后堆积胶凝固，把玻璃板转移到电泳装置并加紧（防止漏液）； 7. 将电泳装置内加入电泳缓冲液并观察是否漏液；

8. 拔掉梳子，用微量注射器冲洗上样孔，加入和上样缓冲buffer混合变性的蛋

白；①蛋白上样量：20-50μg；②上样缓冲液：加入 5×SDS 上样缓冲液至终浓度为 1×；③上样最大体积：根据梳子孔径和玻璃板的距离而定，一般我们用的上样最大体积在30ul左右；④蛋白变性：上样前要将样品于沸水中煮 5-10min 使蛋白变性。可以使用 PCR仪进行变性，99℃5分钟，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：a. EP 管容易炸开，样品丢失；b. 容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量； 9. 在电泳槽中加入电泳缓冲液；

10. 恒压80V 30分钟，100V 2小时左右，溴酚蓝跑到底即可（电泳时间可以根据自己目的蛋白的具体条件设置，一般 4～5 h，电压为 40V 较好，也可用 60V。）；

图1 配胶说明

液体配制

1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 蒸馏水 30.29g 200ml 溶解后，用浓盐酸调 pH 至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至 250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH 7.4 7.5 7.6 8.0 HCl（ml） 17 16 15 10 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 超纯水 45.43g 200ml 溶解后，用浓盐酸调 pH 至 8.8，最后用超纯水定容至 250ml，室温下保存。 10％SDS SDS 蒸馏水至 10g 100ml 50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 超纯水 0.1g 1.0ml 溶解后，4℃保存，保存时间为 1 周。 （可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在 EP 管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可） 30％Acr/Bis（29:1） 丙烯酰胺 Acr N-N-双丙烯酰胺 Bis 29g 1g 溶于总体积为60ml的ddH2O中加热至37℃溶解补水至总体积为100ml查证该溶液的pH＜7.0 过滤后在棕色瓶中4℃保存。 5×loading buffer 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml 二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） SDS 溴酚蓝 甘油 0.39g 0.5g 0.025g 2.5ml 混匀后，分装于 1.5ml 离心管中，4℃保存。 电泳缓冲液running buffer 1x 10x Tris（MW121.14） 3.03 甘氨酸（MW75.07） 18.77 SDS（g） 1 蒸馏水至 1000ml 30.3 187.7 10 溶解后室温保存，次溶液可重复使用 3～5 次。

二、转膜

1. 用marker笔在玻板画线标记目的蛋白的位置；

2. 将玻璃板撬掉剥胶（撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲。）；除去小玻璃板后，切胶并放于电转缓冲液中。

3. 用带有刻度的直尺量出目的蛋白胶的长宽； 4. 剪PVDF膜，大小与胶的大小一致；

5. 把剪好的PVDF膜激活：①放于甲醇15秒；②放于去离子水2分钟；③放于电转液3分钟；

6.剪滤纸，滤纸长宽比膜各小2mm，并放于电转液中；

7.组装转移“三明治”：①硬质海绵充分在电转液中浸泡，挤出里面的气泡；②转移支架底部为黑色，并将1块硬质海绵放于上面；③放置滤纸，并用玻璃棒来回滚压以去除气泡；④放置凝胶，并用玻璃棒来回滚压以去除气泡；⑤放置PVDF膜，并用玻璃棒来回滚压以去除气泡；⑥放置滤纸，并用玻璃棒来回滚压以去除气泡；⑦放置硬质海绵，并用玻璃棒来回滚压以去除气泡。

8. 将组装好的“三明治”固定在转移支架中，然后放到转移装置中，黑对黑，白对红，并放好降温装置，加满电转液；

9. 将电转装置放于冰盒中，盖好盖，250mA 1小时。（1. 实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝纤膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般 80-100V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在 4 度下 12V转膜过夜；2.不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件；3. 转膜时电极方向注意是膜正胶负。）

如果要判断转膜效果，有两种方法：①对转移后的凝胶进行考马斯亮蓝染色或银染；②对转以后的PDVF膜进行丽春红染色。

特别注意：膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教。

液体配制

转移缓冲液 甘氨酸（MW75.07） Tris（MW121.14） SDS 甲醇 蒸馏水至 2.9g 5.8g 0.37g 200ml 1000ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用 3～5 次（次溶液最好保存在 4 度冰箱，最多使用 5 次左右，不然影响转移效率）。 （先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris 和 SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris 和 SDS 等比较困难） （可以配制成 2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）

三、免疫反应

1. 打开电转装置并在膜上剪角标记蛋白面。将膜移至含有封闭液的平皿中，蛋白面朝下，室温下脱色摇床上摇动封闭 1h；

2. 将一抗用奶粉稀释至适当浓度；把平皿中的封闭液用1ml移液器吸出，并加入一抗；室温下脱色摇床上摇动1h，4℃过夜（或37℃孵育1-2h）；第二天在冰箱中取出平皿，室温下脱色摇床上摇动1；回收一抗（可以反复用3次），用 TBST 在室温下脱色摇床上洗3次，每次 5min；

3．同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，37℃孵育 1～2h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗3次，每次 5min；进行化学发光反应。

液体配制

封闭液 （5%脱脂奶粉） 脱脂奶粉 1g TBST 20ml 最好现用现配，4℃保存，最多2天。 TBS 缓冲液 1 mol/L Tris·HCl（pH7.5） 10ml NaCl 8.8g 蒸馏水至 1000ml 可以配制成 10×TBS 缓冲液进行保存，稀释 10 倍使用。 TBST 缓冲液 20％Tween20 TBS 1.65ml 700ml 混匀后即可使用，最好现用现配，4℃保存。， 洗脱抗体缓冲液 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) SDS 2g 700 μl（通风厨里加） 0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml 超纯水至 100ml 配制时，在通风厨内进行，4℃保存。可重复使用 1 次。

四、化学发光

1. 设置成像装置，调整好焦距与清晰度； 2. 设置成像装置，调整到WB成像模式； 3. 配制ECL发光剂（看说明书）；

4. 在滴加发光剂于膜上，并设置成像装置成像。

五、对膜进行二次免疫反应

1. 用洗脱液洗脱膜上的抗体，2次，每次10分钟； 2. 用PBS洗膜2次，每次10分钟； 3. 用TBST洗膜3次，每次5分钟； 4. 室温奶粉封闭1-2小时，后面步骤同前。