北方药学２０１２年第９卷第１Ｏ期 ３１ 一次性包皮环切吻合器无菌检查方法学验证研究 张 萍 朱 菲 （１．安徽省芜湖市食品药品检验所芜湖２４１０００：２．芜湖圣大医疗器械技术有限公司芜湖２４１０００） 摘要：目的：确定一次性包皮环切吻合器的无菌检查方法。方法：采用《中国药典）２０１０年版二部无菌检查方法项下的直接接种 法对样品进行了验证试验，通过验证试验来确定适宜的检查方法。结果：验证试验结果表明，对一次性包皮环切吻合器的无菌 检查可以采用直接接种法。结论：建立了一次性包皮环切吻合器的无菌检查法，方法合理有效，结果可靠。 关键词：一次性包皮环切吻合器无菌检查验证 中图分类号：Ｒ６９９ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１６７２—８３５１（２０１２）１０—００３１—０２ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｖａｆｉｄａｆｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｏｎｅ－ｔｉｍｅ ｃｉｒｃｕｍｃｉｓｉｏｎ ｓ￣ｐＨｎｇ Ｚｈａｎｇ Ｐｉｎｇ Ｚｈｕ Ｆｅｉ０（１．Ｗｕｈｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｗｕｈｕ ２４１０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｗｕｈｕ Ｓｎｎｄａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ａｐｐｌｉａｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｈｓｈ ｔｌ１ｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｏｎｅ—ｔｉｍｅ ｃｉｒｃｕｍｃｉｓｉｏｎ ｓｔａｐｌｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｅｉｒｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ２０１０ Ｅｄｉｉｔｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ，ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｖｅｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｔｏ ｅｎｓｕｒｅ ｔｈｅ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｏｎｅ－ｔｉｍｅ ｃｉｒｃｕｍｃｉｓｉｏｎ ｓｔａｐｌｉｎｇ ｉｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｖｅｒｙ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄ：Ｏｎｅ－ｔｉｍｅ ｃｉｒｃｕｍｃｉｓｉｏｎ ｓｔａｐｌｉｎｇ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ 无菌是指产品中不含任何活的微生物（包括细菌、真菌、 菌室中进行。 病毒及芽孢）。与黏膜、血液接触或植入到体内的医疗器械都 １．２仪器 要按照标准要求进行彻底灭菌。倘若这类医疗器械没有按照 ＨＨ・Ｂ１ １・５００型电热恒温培养箱、ＸＬ２１型霉菌培养箱、数显 要求灭菌，非常容易引起感染，甚至导致生命危险。因此，无菌 恒温水浴锅、ＹＸＱＬＳ一５０Ｓ数显立式压力蒸汽灭菌器、电子天平。 检查是保证医疗器械安全的一个关键环节，是无菌医疗器械 １．３验证用菌种 的必检项目Ｂ１。 金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］、铜绿假单胞菌［ＣＭＣＣ 、大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０２］、枯草芽孢杆菌［ＣＭ— 《中国药典）２０１０年版规定当建立产品的无菌检查法时． （Ｂ）１０１０４］６３５０１］、生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］、白色念珠菌［ＣＭＣＣ 应进行方法的验证，以证明所采用方法适合于该产品的无菌 ＣＣ（Ｂ）检查１＿２，１。一次性包皮环切吻合器为直接接触创伤伤口的无菌医 （Ｆ）９８００１］、黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３１，以上菌种均购自中国药 实验用菌种为其第二代培养物。 疗器械，为确保临床使用的安全性，需对其进行无菌检查。本 品生物制品检定所，４培养基及稀释剂 文采用直接接种法对此样品进行无菌检查，通过方法学验证 １．确定了一次性包皮环切吻合器的检验条件和方法。 无菌０．９％氯化钠溶液；硫乙醇酸盐流体培养基；改良马丁 培养基；营养肉汤培养基；营养琼脂培养基；虎红琼脂培养基。 １实验环境及材料 １．１实验环境 培养基均购自上海博微生物科技有限公司。 ５样品 在环境洁净度万级、局部洁净度百级的单向流空气的无 １．１２］Ｚｈｅｎｇ Ｌ，Ｄａｉ Ｈ，Ｚｈｏｕ Ｍ，ｅｔ ａ１．ＦＥＮ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ａｕ－ ［５］Ｊｅｍａｌ Ａ，Ｍｕｒｒａｙ Ｔ，ＷａＩｄ Ｅ，Ｓａｍｕｅｌｓ Ａ，Ｔｉｗａｒｉ ＲＣ， ｆｏｉｍｍｕｎｉｔ，ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒｓ ｆＪ］．Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００７， Ｇｈａｆｏｏｒ Ａ，Ｆｅｕｅｒ ＥＪ，Ｔｈｕｎ ＭＪ．Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｉｔｃｓ，２００５［Ｊ］．ＣＡ ｔＣａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ。２００５，５５（１）：１０—３Ｏ． １３：８１２—８１９． １３］Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｍ，Ｙａｎｇ Ｋ，Ｋｕｒａｇｕｃｈｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉ— ［６］Ｃｏｏｐｅｒ ＰＲ，Ｎｏｗａｋ ＮＪ，Ｈｉｇｇｉｎｓ ＭＪ．Ｔｒａｎｓｃｉｒｐｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ［ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １ ｌｑ１２一ｑ１３．１ ｇｅｎｅ—ｆｉｃｈｒｅｇｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｓｅｖ— ｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｆｅｎ１）ｌｅａｄｓ ｔｏ ｒａｐｉｄ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓ－ ｅｒａｌ ｎｅｗｌｙ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｇｅｎｅｓ【Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｅ，１９９８，４９ ｓｉｏｎ［Ｊ］．ＰＮＡＳ，２００２，９９：９９２４—９９２９． （３）：４１９—４２９． 『１４］Ｓａｔｏ Ｍ，Ｇｉｒａｒｄ Ｌ，Ｓｅｋｉｎｅ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆ１ａＤ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ （ＦＥＮ１）ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆ７１Ｈｅｎｎｅｋｅ Ｇ。Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ—Ｈｅｉｎｅｋｅｎ Ｅ，Ｈｕｅｂｓｃｈｅｒ Ｕ．Ｆｌａｐ ｅｎ－ ｎｏ ｍｕｔａｔｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ［］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，３２００３，２２：７２４３－７２４６． ｄｏｎｕｅｌｅａｓｅ １：ａ ｎｏｖｅｌ ｔｕｍｏｕｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ叨．Ｔｒｅｎｄｓ ｌＢｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，２００３，２８：３８４—３９０． 『１５］Ｋｉｍ ＪＭ，Ｓｏｈｎ ＨＹ，Ｙｏｏｎ ＳＹ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｅｄ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ［８］Ｋｌｕｎｇｌａｎｄ Ａ，Ｌｉｎｄａｈｌ Ｔ．Ｓｅｃｏｎｄ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ—ｒｅｌａｔｈｕｍａｎ ＤＮＡ ｂａｓｅ ｅｘｃｍｉｏｎ—ｒｅｐａｉｒ：ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｆｉｏｎ ｗｉｔｌｌ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓＯ］．Ｃｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮａｓｅ ＩＶ（ＦＥＮ１）［Ｊ］．ＥＭＢＯ Ｊ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ。２００５，ｌ１：４７３—４８２． ［１６］ＬａＴｕｌｉｐｐｅ Ｅ，Ｓａｔａｇｏｐａｎ Ｊ，Ｓｍｉｔｈ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ １９９７．１６：３３４１—３３４８． ｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｒａｎ— 『９１Ｗｕ Ｘ，Ｗｉｌｓｏｎ ＴＥ，Ｌｉｅｂｅｒ ＭＲ．Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＦＥＮ一１ ｉｎ ｎｏｎｈｏ— ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｍｏｌｏｇｏｕｓ ＤＮＡ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ：，Ｉ１ｌｅ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ［３３．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００２，６２：４４９９—４５０６． ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｅｖｅｎｔ￣［３．ＰＮＡＳ，１９９９，９６：１３０３—１３０８． １７］Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ—Ｄｏｎａｈｕｅ ＣＡ，Ｍａｉｔｒａ Ａ，Ｏｌｓｅｎ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｆ１０］Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｋ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｙ，Ｈａｔａｎａｋａ Ａ，ｅｔ ａ１．ＦＥＮ一１ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ 『ｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｔ ｏｆ ｇｌｕｓｉｎｇ ｅＤＮＡ ｍｉｅｒｏａｒｒａｙｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２００３，１６２：１ １５１—１ １６２． ＤＮＡ ｂｒｅａｋ ｅｎｄｓ［］３．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００５，２５：６９４８－６９５５． １８］Ｋｒａｕｓｅ Ａ，Ｃｏｍｂａｒｅｔ Ｖ，Ｉａｃｏｎｏ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｍｅ—ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ 【１１］Ｚｈｅｎｇ Ｌ，Ｚｈｏｕ Ｍ，Ｃｈａｉ Ｑ，ｅｔ ａ１．Ｎｏｖｅｌｆｕｎｅｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔ ｆｌａｐ ｆｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｅｌｅｕｓｅ ｌ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｔａｌｌｅｄ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｆｏｒｋｓ［Ｊ］．ＥＭＢ０ Ｒｅｐ，２００５，６：８３—８９． ［３．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２００５，２２５：１１１－１２０． ３２ 北方药学２０１２年第９卷第１０期 ，再分别接 次性包皮环切吻合器（生产单位：芜湖圣大医疗器械技 法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基１８０ｍｌ入上述计数符合要求的各稀释级别的金黄色葡萄球菌、大肠 术有限公司；规格：自锁式Ｃ型；批号：２０１１１００６）。 埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和生孢梭菌各２个，另１ ２方法与结果 ２．１菌悬液制备 个不接种作为空白对照；在５个体积为２００ｍｌ的烧杯中分别 ２．１．１接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿 加入符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基 ８０ｍｌ，再分别接入上述计数符合要求的各稀释级别的白色念 假单胞菌的新鲜培养物至８０ｍｌ营养肉汤培养基中，３５℃培养 １１８小时，用０．９％无菌氯化钠溶液分别稀释至１０ 、１０ 、１０一、 珠菌、黑曲霉菌各２个，另１个不接种作为空白对照。在上述 接种相同菌液的平行两个培养基中，一个加入１个供试品，另 １０４，制成每ｌｍｌ含菌数为小于ｌＯＯｃｆｕ的菌悬液。 ２．１．２接种白色念珠菌的新鲜培养物至８０ｍｌ改良马丁培养基 １个作为对照。细菌于３５２２培养３天，真菌于２８￣Ｅ培养５天， 中，培养１８小时，用０．９％无菌氯化钠溶液稀释至１Ｏ ，制成每 每天观察并记录实验结果，结果见表３。 一ｈｎｌ含菌数为小于ｌＯＯｃｆｕ的菌悬液。 ２．１．３取２５２２培养７天的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，加 １５ｍｌ Ｏ．９％无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子。吸取出ｌｍｌ孢子悬 液，然后用０．９％无菌氯化钠溶液稀释至１０ ，制成每ｌｍｌ含菌 数为小于ｌＯＯｃｆｕ的菌悬液。 ２．１．４接种生孢梭菌的新鲜培养物至５０ｍｌ硫乙醇酸盐流体培养 表３验证试验记录 基中，３５２２培养１８小时，用０ 无菌氯化钠溶液稀释至１Ｏ ，制 成每ｌｎｆｌ含菌数为小于ｌＯＯｃｆｕ的菌悬液。 ２．２菌悬液计数（结果见表１） 表１菌悬液计数（菌落计数结果平均值。单位ｃｆｕ／ｍ１） ２．３培养基适用性检查 ２．３．１无菌ｌ生检查：取上述硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培 养基各制备成灭菌溶液，在相应条件下培养１４ｄ，结果为无菌 生长。 ２．３．２灵敏度检查：取每管装量为１２ｍｌ的硫乙醇酸盐流体培养 注：一表示不生长；＋表示生长良好。 基Ｉ １支，分别接种２．１中＜ｌＯＯｃｆｕ各稀释级别的大肠埃希菌金 从上表可知，阳性供试品组与阳性对照组中试验菌细菌 黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各２ 均在３ｄ内生长良好，真菌均在５ｄ内生长良好符合验证要求。 支，另１支不接种作为空白对照，培养３ｄ；取每管装量为９ｍＩ 则本品采用以下方法进行无菌检查：在７个体积为２００ｍｌ 的改良马丁培养基５支，分别接种２．１中＜ｌＯＯｃｆｕ各稀释级别 的烧杯中分别加入符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇 的白色念珠菌、黑曲霉菌各２支，另１支不接种作为空白对 酸盐流体培养基１８０ｍｌ，其中１个作为阴性对照；其他６个中 照，培养５ｄ，逐日观察结果。结果：空白对照管无菌生长，加菌 分别直接加入供试品原样一个，再从中取１个接入菌量小于 的培养基管均生长良好，灵敏度检查符合规定［２１。见表２。 表２培养基灵敏度检查 ｌＯＯｃｆｕ的金黄色葡萄球菌作为阳性对照。 在６个体积为２００ｎｌ的烧杯中分别加入符合直接接种法 ｉ培养基用量要求的改良马丁培养基１８０ｍｌ，其中１个作为阴性 对照；在其余５个培养基中直接加入供试品原样一个。细菌于 ３５２２培养１４天，真菌于２８２２培养１４天，每天观察并记录实验 结果。 ３讨论 考虑到样品为一次性的医疗器具，材料本身为不含抑菌 成分的硬质塑料，样品的形状为环形，直径大于一般三角烧瓶 的瓶口，根据以上特性，验证方法采用了直接接种法。实验时 采用了广口的烧杯，将样品完全浸没于培养基中，杯口用无菌 纱布封ＶＩ，保证了实验的无菌操作。 参考文献 ［１］刘全芳，郑绍忠，张婷．乳酸依沙吖啶注射液无菌检查方法验 证（Ｊ】．中国药师，２０１１，７（Ｉ４）：９９８—１０００． ［２国家药典委员会．２］中国药典（二部）【Ｓ】．北京：化学工业出版 注：一表示不生长；＋表示生长良好。 ２．４方法的选择及方法验证试验 在１１个体积为２００ｍｌ的烧杯中分别加入符合直接接种 社，２０１０：附录１０３．
