维普资讯 http://www.cqvip.com 标记免疫分析与ｌ临床２００７年９月第１４卷第３期 １８１ ＥＣＬＩＡ法与传统ＥＬＩＳＡ法检测ＴＮＦ一 比较 李琦，王东琳，张赘，陈立杰，王春艳，徐竹蔚，金伯泉 （第四军医大学免疫学教研室，陕西西安 ７１００３２） 化学发光酶联免疫检测法（ＥＣＬＩＡ）是将酶免 疫系统与化学发光系统结合起来，通过发光强度 （ＲＬＵ）反映检测样品含量的一种免疫学检测技 术Ⅲ。本实验建立了ＥＣＬＩＡ法，并将其与传统 ＥＵＳＡ法在其敏感性上进行对比，结果表明， ＥＣＬＩＡ法较ＥｕＳＡ法敏感性提高４倍，报道如 下。 材料和方法 （ｃｏ＇｜×一 １ 材料 ４ ２ Ｏ ８ ６ ４ 重组人ＴＮＦ—ａ夹心ＥＬＩＳＡ检测试剂盒由本 室研制ｌ＿２］，ＥＵＳＡ板为Ｎｕｎｃ公司产品，ＥＣＬＩＡ板 为珀金埃尔默公司产品，酶联免疫检测仪为ＢＬＯ— ＲＡＤ公司产品，ＧＥＮｉｏｓ型化学发光免疫分析仪为 瑞士ＴＥＣＡＮ公司产品。Ｌｕｍｉｇｅｎ ＡＰＳ－５发光剂 为美国Ｌｕｍｉｇｅｎ公司产品，单磷酸酚酞显色剂 （ＰＭＰ），显色终止液，为北京倍爱康生物技术有限 公司产品。 ２ 方法 ＥＣＬＩＡ检测重组人ＴＮＦ—ａ方法的建立，按常 规方法用包被缓冲液将抗ＴＮＦ—ａｍＡｂ Ｆ６（１０￣ｇ／ ｍＬ）包被ＥＬＩＳＡ板，１００“Ｌ／孔，４℃过夜；洗涤液 （ＰＢＳ）洗涤４次，将ＴＮ卜ａ标准品（１０ ｎｇ／ｍＬ）用 抗体稀释液（１ｇ／Ｌ ＢＳＡ／ＰＢＳ）倍比稀释后每孔加 １００ｇＬ，室温孵育１ｈ，洗涤４次。标记ＡＰ的抗 ＴＮＦ—ａ另一株ｍＡｂ Ｄ２按１：１０００稀释后，按 １００ｇＬ／孔加入板中，室温孵育１ｈ，洗涤４次，每孔 加入５０ｇＬＡＰＳ－５发光剂后，直接用发光仪测定发 光强度（ＲＬＵ）。夹心ＥＬＩＳＡ检测重组人ＴＮＦ—ａ 按常规方法。 结 果 ＥＣＬＩＡ与ＥＬＩＳＡ方法检测ＴＮ Ｆ＿ａ比较，以 ＴＮＦ—ａ标准品浓度为横坐标，检测ＴＮＦ—ａ相应４ 孔平均Ａ５５Ｏ（ＥｕＳＡ）或４孔平均相对发光单位 收稿日期：２００７－０２－０５；修回日期：２００７—０３－２９ ＲＬＵ（ＥＣＬＩＡ）为纵坐标绘制回归曲线，见图１、２。 ０ ０．２ ０．４ ０．６ ０．８ １ １．２ １．４ ＴＮＦ—ａ浓度（ｐｇ／Ｌ）２ ２ ｌ】 ｌ Ｏ Ｏ ２ ６ ２ ８ ４ Ｏ ６ ２ Ｏ 图１ ＥＣＬＩＡ检测ＴＮＦ－ａ标准曲线 遥 ＾ ｌ Ｖ 髓 船 ｌ ３ ５ ７ ９ 】１ ｎ 一ａ浓度（ｐｇ／Ｌ） 图２ ＥＬＩＳＡ检测ＴＮＦ—ｄ标准曲线 各标准点计算浓度与实际浓度之比（回收率） 在９Ｏ ～１１０ 之间，且达到了线性关系最佳，并 拟合为回归方程。用ＥＣＬＩＡ或ＥＬＩＳＡ法测量２Ｏ 孔阴性对照获得相应Ａ。。。或发光强度值（ＲＬＵ）， 计算其平均值（ ）和标准差（ｓ），以 ＋２ｓ值相对 应浓度为检测灵敏度。ＥＣＬＩＡ法１５ｐｇ／ｍＬ较 ＥＬＩＳＡ法６２ｐｇ／ｍＬ检测敏感性提高４倍。 讨 论 利用本室研制的重组人ＴＮＦ—ａ夹心ＥＬＩＳＡ 检测试剂盒，将ＥＣＬＩＡ法与ＥＬＩＳＡ法进行了对 比，表明ＥＣＬＩＡ法敏感性高，实验系统稳定，由于 加入发光剂后无需孵育从而缩短了检测时间（即 ０．５ｈ），整个实验均可在室温下进行，避免了因反应 温度及时间的影响而造成的误差。 暾米越 维普资讯 http://www.cqvip.com １８２ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，Ｓｅｐ．２００７，Ｖｏ１．１４，Ｎｏ．３ ＥＣＬＩＡ原理是，化学发光物质在酶的催化作 用和氧化剂的作用下，形成一个激发态的中间体， 当这种激发态中间体回到稳定的基态时发射出光 参考文献： ［１］Ｈａｌｍａｎｎ Ｍ，Ｖｅｌａｎ Ｂ，Ｓｅｒｙ Ｔ．Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉ— ｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ ａ ｃｈｅｍｉｌａｎｍｉｎｅｓ— 子，光信号强度可以用仪器测量，在一定浓度范围 内，光信号强度与酶的含量成正比＿３］。目前 ＥＣＬＩＡ最常用的ＡＰ底物有两种，一种为（金钢 烷）－１，２－－－氧乙烷及其衍生物。另一种为二氧杂 ｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｒｅ—ａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｅｎｃｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９７７，３４ （５）：４７３－４７７． ［２３刘雪松，金伯泉，许辉，等．抗重组人肿瘤坏死因子一ａ单克隆抗 体的研制及其初步应用［Ｊ］．单克隆抗体通讯，１９９５，１１（２）：８— 环丁烷类化合物＿４］，本文的Ｌｕｍｉｇｅｎ ＡＰＳ一５就属 １０． 于后者，这种发光底物特点是：①极高的灵敏度，能 Ｅ３］韩佩珍．化学发光免疫分析［Ｊ］．国外医学：放射医学检医学分 够检测到少于１０ 。摩尔的ＡＰ分子；②在极短时 册，２００２，２４（５）：１９６—２００． ［４］尹东光，贺佑年，刘兵，等．几种主要化学发光物质的发光性能 间内发光强度即达到峰值并长时间保持稳定；③线 及基化学发光免疫分析体系［Ｊ］．标记免疫分析与临床，２００２， 性范围宽大；④在２０～３５℃内温度对发光反应无 ９（４）：２２５－２３０． 明显影响，基于以上优点，ＥＣＬＩＡ技术值得推广应 （李 宁、陈泮藻编辑） 用。 （上接第１８０页） 当改变ＣＡ１２５的检测ｌ｝缶界值，动态观察血清 到六个月肿瘤标志物水平恢复正常，说明可以使用 ＣＡ１２５的变化及与其它肿瘤标志物联合应用，可 肿瘤标志物下降的幅度和时间来判断肿瘤治疗效 以避免假阴性的发生，及时了解病情。此外， 果。 ＣＡ１９—９含量＞ＩＯＯＵ／ｍＬ的占总例数的２２．４ 参考文献： （１３／５８），ＣＡ１９—９在Ｉ期、Ⅱ期随着分期的增加阳 性率也增加，但后期却没有，考虑卵巢癌例数太少， ［１］Ｔｈｏｌａｎｄｅｒ Ｂ，Ｔａｕｂｅ Ａ，ＩＡｎｄｇｒｅｎ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｅｒ— 尚需进一步积累。也不排除ＣＡ１９—９是消化道肿 ｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＣＡ １２５，ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ，ｔｉｓｓｕｅ ｐｏｌｙｐｅｐ— 瘤的指标，对卵巢癌的指导意义不大。ＣＥＡ在本 ｔｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ａｎｄ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｙｐｅ，ｇｒａｄｅ ｏｆ 组中有两组升高，分别为直肠癌卵巢转移和１例浆 ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎ— 液性腺癌直肠转移。 ＣＯｌ，１９９０，３９（３）：２５ ３５． 在恶性卵巢肿瘤诊断中，肿瘤标志物ＣＡ１９— ［２］Ｐｒａｔｉｋ Ｋ，Ｍａｄａｎ Ｍ Ｒ，Ｌａｌｉｔ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒ ＣＡ一１２５ ９、ＣＥＡ的灵敏度都不高，但它们的特异性较高， ａｓ ａｎ ｅｖａｌｕａｔｏｒ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ：ｉｔｓ ＣＡ１９—９、ＣＥＡ和ＣＡ１２５联合检测，对于诊断卵巢 ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ［Ｊ］．Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ， ２００５，１１（２）：ＣＲ ８４ ＣＲ ８９． 癌起互补作用，增加灵敏度。在恶性卵巢肿瘤随访 （李 凌编辑） 中，患者经手术治疗和定期化疗，肿瘤标志物呈显 著下降趋势，除个别晚期患者外，多数在第四个月
