腺病毒中文操作手册

腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册

目录

第一章简介1

第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒

Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒 AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对

BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白 cDNAComplementaryDNA互补DNA

cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应 CsClCesiumChloride氯化铯

DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基 DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜 DTTDithiothreitol二硫苏糖醇

EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸 EtBrEthidiumBromide溴化乙锭 FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时

ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复 KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿

LBLuria-Bertani(broth)LB培养基 MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟

MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数 mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off

PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳 PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液 PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后

RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒 RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复 SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠

TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸

TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量

TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型

X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷

3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4

4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1

第一章简介

当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。

1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广

泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hittetal，1999和Wiveletal，1999。腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massieetal，1998A,B）。但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（Heetal，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。

这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分购买后即可使用。

第二章应用重组腺病毒的优点

1.宿主范围广,对人致病性低

这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。 2.在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因

逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。 3.能有效进行增殖，滴度高

这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。

4.无需辅助病毒，可容纳7.5kb外源DNA：为提供克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。此外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105%）。这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。 5.与人类基因同源

该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。 6.不整合到染色体中，无插入致突变性

逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。

7.能在悬浮培养液中扩增：293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表达重组蛋白。 8.能同时表达多个基因

这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。

第三章AdEasyTM技术

3.1技术概览

在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PmeI线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR，IavertedTerminedRepeats），转染QBI-293A细胞后产生重组病毒颗粒。

同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的

其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5α等进行扩增。由于缺乏recA活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重组。 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程

与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需1-3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5α中扩增后转入哺乳动物细胞293A，最后将293A细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供E1区功能的293A细胞中进行增殖。

一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需1小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。 我们强烈建议初学者用QBI-Infect＋阳性对照进行感染力测定（见5.2.2

第四章主要流程

4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体

AdEasyTM系统中有2种转移载体可供进行重组腺病毒构建：pShuttle和pShuttle-CMV，这2个载体都含有多克隆位点（MCS）供插入基因。pShuttle不含有启动子和多聚腺苷酸位点（polyA），允许插入含特定启动子和polyA位点的表达盒。pShuttle-CMV含有单拷贝CMV启动子和polyA位点供基础表达和高表达重组蛋白，你只需将目的基因插入pShuttle-CMV的多克隆位点。表1提供了各转移载体的特性。 表1AdEasyTM转移载体特性

载体名称克隆能力启动子polyA位点克隆位点线性化位点说明 pShuttle7.5kb——MCS共转化位点PmeI（ECoRI） 转染位点（PacI）将完整的表达盒装入多克隆位点（MCS） pShuttle-CMV6.6kbCMV+MCS共转化位点PmeI（ECoRI）

转染位点（PacI）CMV启动子能在大多数哺乳动物细胞中高效表达蛋白 4.1.1 克隆的一般原则

AdEasyTM转移载体的特殊设计使其极易在克隆中应用，但在设计克隆策略时应考虑以下因素：

1）在BJ5183中进行共转化之前必须将转化载体线性化。确证表1中所列的线性化位点不存在于插入的基因中。注意：在pShuttle中用EcoRI线性化时，需要用RecA辅助的性内切酶进行酶切。如果插入基因含有所有线性化酶切位点，那么必须进行定向突变。

2）重组腺病毒质粒在转染QBI-293A65℃20分钟进行灭活。

5．凝胶纯化线性化载体。尽管胶纯化可能会降低转化效率，但不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率。将线性化质粒去磷酸化也有助于降低背景信号。

6．重悬纯化的DNA，浓度至少为0.2ug/ul。每个转化实验取1ug进行，包括对照。 4.2细菌内AdEasyTM重组子的产生2mm电穿孔杯，防止有气泡形成。

4．按电穿孔供应商的使用说明转化BJ5183，Bio-Rad仪器一般使用的参数为：200Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：5Ohms、2.5KV、C=0。 5．用1mlLB重悬转化物。

6．转入15~50ml离心管中，37℃震荡培养60分钟。

7．将转化物铺3~5块LB/Kan（50ug/ml）培养板，37℃4.3AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 将侯选重组子进行酶切分析，验证其结构。比如：PacI酶切后通常得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重组位置在左臂还是复制子而不同。建议同时用克隆基因的内切酶进行分析，鉴定是否含有插入基因。挑选最佳阳性重组子转入DH5α中进行扩增：转化DH5α只需1-5ul小量制备的重组子。这一步对于扩增时保持重组DNA的结构是必需的，因为AdEasyTM这样的大质粒在recA+细菌株如BJ5183中是不稳定的，会迅速出现缺失,而在DH5α中能很容易地获得大量DNA。

1．将DH5α感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。

2．将1-5ulDNA加入40ulDH5α感受态细胞中，DNA必须用水溶，避免含有离子。 3．将DH5α感受态细胞转入2mm电穿孔杯，防止形成气泡。

4．按照说明转化DH5α：Bio-Rad仪器一般使用的参数为：200Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：50Ohms、2.5KV、C=0。

5．将转化混合液重悬于1mlLB中。

6．转入15-50ml离心管中，37℃振荡培养60分钟。

7．培养后用LB按一定梯度稀释转化的DH5α（1:10、1:100和1:1000）

8．取100ul转化液铺在LB/Kan（50ug/ml）板上，37℃培养24小时。未用的转化液可在4℃保存-2周。

9．每个重组子挑1~3个克隆转入5mlLB扩增，以备有足够量质粒。这时，用内切酶再次分析重组DNA，以确证含有插入基因，以及重组子的稳定性。

10．用柱纯化试剂盒制备至少5ug高质量的重组DNA。

11．取5ug质粒用PacI消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在无菌条件下溶于50ul0.1×TE溶液。具体要求参见磷酸钙技术一章中有关转染前DNA制备的内容。 4.4AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 注意：培养细胞前先参阅5.1章中有关QBI-293A-293A细胞在60mm培养皿中铺板，用DMEM5%培养，第二天的细胞数应达到1.0~1.5×106。37℃2M氯化钙溶液。上下吸打二次混匀，然后一滴一滴加入50ulAdVDNA溶液和26ul2M氯化钙，再用移液慢慢吹打混匀。此时缓冲液的体积为250ul，含有0.25M氯化钙和5ugDNA。 3．准备第2管离心管（编号2），加入250ul2×HBS缓冲液。

4．用1ml移液吹打2号管中的溶液形成气泡，在吹打的同时逐滴加入1号管的溶液。加完后继续吹打5秒以使其完全混匀。这一步骤对于形成的共沉淀颗粒的大小至关重要，小颗粒转染效率更高，而吹打可以形成较小的颗粒。等一分钟后再加入细胞培养皿内。

5．在超净台内将磷酸钙-DNA共沉淀混合物逐滴加入到培养皿中，覆盖范围尽可能广。培养液稍后即会透明，十字形晃动培养皿使沉淀均匀分布。

6．培养皿放入孵箱培养过夜。4小时后，沉淀颗粒在200×倒置显微镜下应清晰可见，尤其在无细胞的培养皿表面。 7．第二天，去除含共沉淀颗粒的培养液，用PBS制备的1mMEDTA溶液洗一次，PBS洗2次。

注意：转染后细胞都十分脆弱，容易脱壁。清洗时应十分轻柔，将PBS沿培养皿壁加入，然后轻轻旋转培养皿。用移液反复将培养液直接加在细胞上，即可使细胞脱落，然后收集。由于这一时期细胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。 8．将细胞分装入4个60mm培养皿（每个培养皿中加5mlDMEM5%）或一块6孔板中（每孔加3mlDMEM5%），静置6小时使其贴壁。6小时后覆盖琼脂糖以供形成病毒空斑。 第五章常用技术 5.1QBI-293A细胞培养 昆腾公司的293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293作为第一代，则30代内能得到最佳结果。一旦到了30代，最好复苏一管细胞开始新的培养。所以，我们建议你在收到细胞后应尽快建立自己的QBI-293A细胞库。

QBI-293A细胞在DMEM培养液中培养，该培养液还含有4.5g/LL-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺和胎牛血清。血清浓度为2%~10%，视实验需要来调节细胞生长速度。为简化此操作说明，培养基描述为DMEM后加血清浓度（如：DMEM5%表示：含有4.5g/LL-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、终浓度为2mM的谷氨酰胺和终浓度为5%的热灭活胎牛血清）。 QBI-293A细胞需按标准的细胞培养规程进行操作，在健康状态时，它们呈成纤维细胞样并在培养瓶中贴壁形成单层细胞。被感染的细胞则变圆脱落，即所谓的细胞病理效应（CPE）。所有的细胞培养操作都应严格遵循无菌原则，这一点是至关重要的。抗生素可用可不用，但无抗生素条件对于操作质量来说通常是一个好的对照。 QBI-293A细胞生长的相对密度见下表：

表2：汇合率与细胞数量汇合率(%)60mm培养皿100mm培养皿 501.60×1063.5×106 752.40×1065.25×106 1003.20×1067.00×106 5.1.1QBI-293A细胞初始培养

1.将冻存的一管QBI-293A细胞在37℃水浴轻轻晃动融化。

2.融化后在超净台无菌条件下用70%乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净。

3.将细胞转入15mL无菌离心管中，加入10mLDMEM10%，600×g离心5分钟使细胞沉淀。 4.弃去上清。

5.将细胞用10mLDMEM10%重悬，轻轻打匀

6.转入75cm2培养瓶或100mm培养皿中培养。 7.在5%CO2孵箱中37℃-293A细胞的维持培养和增殖 QBI-293A-293A细胞的冻存

建立细胞库时必须使培养的细胞汇合率低于50%，以保证亚克隆的特定表型。 1.QBI-293A细胞必须在含10%高质量FBS的DMEM中培养。 2.将健康生长的QBI-293A细胞离心沉淀。 3.以最小体积的DMEM10%重悬细胞。 4.用血球计数器进行细胞计数。

5.用DMEM5%+10%DMSO+40%FBS重悬细胞，细胞终浓度为1×106/mL。 6.无菌操作将1mL细胞悬液转入2mL冻存管中。

7.将冻存管放入冻存盒中，-80℃储存24小时。这一简便措施可保持约1℃/分钟的降温速率，适于冻存细胞。 8.第二天将冻存的细胞转入液氮罐或-150℃冰箱中长期保存。QBI-293A细胞若正确冻存，则可在液氮罐中保存数年。 5.2QBI-293A细胞的感染和病毒空斑的产生

感染QBI-293A细胞和产生病毒空斑在这本手册的多种操作中都得到应用，其具体操作视不同的实验目的而稍有差异（如滴度测定、大规模扩增和纯化）。这一节提供了一个基本的操作说明，并详细描述了QBI-293A细胞感染后不同时间的具体变化。 -293A细胞 QBI-293A细胞中腺病毒的感染周期表现为光镜下可见的细胞表型的改变，此周期始于病毒和细胞接触后。被感染细胞的表型变化与病毒接触的时间以及病毒细胞比率相关，这个比率称为感染复数（MOI）。病毒控制细胞并阻止细胞的生长需要几个小时的时间。

当QBI-293A细胞在MOI值为1或更低的情况下被感染，则只有一部分细胞能被感染。此时感染所有的细胞必须产生完整的感染周期并释放病毒，整个过程大概需要4天。在这个过程中，未被感染的细胞将继续生长，细胞可能在未被全部感染时达到100%汇合率而停止生长。感染后的表现是多种多样的，但典型的表现是在感染后5天可见大多数细胞呈现CPE而其余的细胞表现为原来未被感染的形态。

感染的操作很简单，只要将病毒与细胞接触。为增加感染的有效性，在最初2小时感染中最好将培养液的体积减到最小，这样病毒与细胞接触得会更紧密，然后再增加培养液。此外，缓慢而持续地晃动培养板（Mitterederetal.1996）可使病毒分布更均匀，从而使感染效果更好。

注意：处理细胞和病毒时都必须使用消毒的头。

病毒空斑形成源于一个细胞被一个病毒感染后，经过多次完整的感染周期释放病毒再感染周围的细胞。病毒空斑的形成是一个缓慢的过程，甚至在光镜下能观察到空斑之前，细胞已经达到100%汇合。为病毒的扩散，通常在培养液中加入琼脂糖，但在琼脂糖覆盖下观察细胞形态的改变则要稍微困难一些。

感染后7天左右可以在显微镜下看到小的空斑，表现为一定区域内细胞呈现CPE。第10天可以在光镜下看到形态完整的空斑，有经验的研究者则能凭肉眼观察到培养板底部有小的空白斑点形成。到14天，空斑可非常容易地被挑选出来。

将琼脂糖覆盖细胞不是一项容易的技术，你必须在琼脂糖凝固之前迅速地将它在单层细胞上完全铺匀。但是如果铺得太快太重，那么细胞往往会脱壁。但通过几次实验后，这一步应该比较容易了。 琼脂糖/DMEM混合物制备：

1.用无菌PBS制备5%SeaPlaque琼脂糖（FMC产品）储存液，高压消毒后每管10mL分装在50mL塑料离心管中，4℃保存。

2.使用之前先在微波炉中融化5%SeaPlaque琼脂糖（避免沸腾），然后冷至45℃。防止琼脂糖沸腾最好的办法是在沸水浴中加热，如果没有完全融化的话再在微波炉中加热数秒。

3.加入30mL预平衡至37℃的DMEM5%后充分混匀，这样琼脂糖的终浓度为1.25%。立即使用。 覆盖QBI-293A细胞：

在进行下一步操作之前，请确认细胞是否已贴壁完好。 1.移去培养液，用1.25%琼脂糖/DMEM混合物覆盖单层细胞。

2.沿着培养板的边缘将琼脂糖轻轻加入，加入的具体体积参考表3，然后放回CO2孵箱培养。 表3：不同培养器皿应用的琼脂糖体积 培养皿大小首次量追加量 100 mm10mL5mL 60 mm5mL3mL 6孔板3mL1.5mL

空斑应在10~21天内形成，为保持细胞活力，每4~5天或培养基变黄时追加琼脂糖/DMEM混合物。 5.3MOI测定 这一实验用来粗略估计病毒上清中病毒颗粒的数量（精确测定病毒颗粒数量见5.8节的滴度测定）。MOI测定通常在扩增病毒尤其是在大量扩增的时候使用，以确定感染的最佳条件。 这一实验可在含有1×106QBI-293A细胞/孔的6孔板中进行。 1.移去培养液，每孔加入500μL新鲜的培养液

2.一孔为对照，其余每孔分别加入2、5、10、25、50μL病毒上清。 3.不断缓慢晃动培养板，培养约3小时。 4.加入1.5mL新鲜培养液培养72小时。

观察每孔细胞是否出现CPE，根据预先的估计，感染后3天细胞完全出现CPE的病毒MOI值为10~20。这样，根据感染的细胞数量，你就可以估计出上清中的病毒量。 5.4腺病毒感染力测定 这一实验的目的是确定腺病毒是否能将DNA转导入293之外的某一细胞株。该实验至关重要，因为它将确定腺病毒是否可应用于这个细胞株，以及如果能应用则需要多少的病毒量（也就是需要大量扩增的程度）来完成整个研究。这个实验中，如果用的是Ad5-CMV-LacZ则检测β-半乳糖苷酶，Ad5-CMV-GFP或Ad5-CMV5-GFP则检测GFP。这些高滴度的产品都可单独向昆腾公司购买。本实验的阳性对照（β-半乳糖苷酶检测）亦可向昆腾公司购买，但由于病毒滴度太低而不适于直接进行实验，通常需要扩增以达到理想的病毒滴度（扩增步骤见5.6）。 腺病毒转导的效率各个细胞株都不太一样，其中尤以淋巴细胞株最难转导。

腺病毒感染力测定通常在多孔板中进行，MOI为1~200，当测定淋巴细胞株时MOI可至1000。对大多数细胞株来说，1~50的MOI值可将报告基因转入所有的细胞而不会出现任何的毒性。在高MOI情况下，某些病毒蛋白的高表达可对某些细胞产生毒性。无论MOI为多少，感染时都必须用最小的培养液体积并不断晃动，以使感染效果达到最佳。

1.按5.2.1℃预热的PBS冲洗一遍，然后加入足量固定液（戊二醛或多聚甲醛）以覆盖细胞，0.05%戊二醛室温孵育5~15分钟或2%多聚甲醛室温孵育60分钟。

2.弃去固定液，室温下用PBS彻底洗3遍：第一遍将冲洗液立刻弃去，第二、第三遍则让冲洗液保留5分钟。 3.加入最小体积的X-gal溶液。

4.37℃孵育1至12小时（过夜），阳性细胞将被染成蓝色。染色完成后可将培养板置于4℃保存。 溶液：

a）戊二醛固定液

使用前将戊二醛用PBS稀释至终浓度为0.05%。 b）多聚甲醛固定液

1.将2g多聚甲醛溶解在50mL预热至55℃的水中。 2.加入2滴10NNaOH，溶液将变澄清。

3.待多聚甲醛溶解后，加入10mL0.2M磷酸二氢钠（2.76g/100mL）和40mL0.2M磷酸氢二钠（无水，3g/100mL）。 4.固定液在37℃条件下加入，在室温下固定。多聚甲醛固定液可在4℃最长保存一个星期。 c）X-gal溶液

用PBS制备（PH7.4）： 20mM氰铁酸钾(K3Fe(CN)6) 20mM氰亚铁酸钾(K4Fe(CN)63H2O) 2mMMgCl2或MgSO4

使用前加入X-gal储存液（20mg/mL溶于N,N-二甲基甲酰胺），终浓度为1mg/mL。

上述三种X-gal染色用的溶液可在室温下保存数月，溶于N,N-二甲基甲酰胺的X-gal储存液则可于-20℃在玻璃容器中储存，用箔包裹后避光保存。

5.5重组腺病毒的筛选和纯化表4：各种筛选方法的特性 筛选方法优点缺点

Western杂交显示表达蛋白的完整性 显示插入基因的蛋白表达水平

需要表达蛋白的抗体可以用与其它蛋白有交叉反应的抗体，因为蛋白会在胶上得到分离 得到最终结果需两个星期 Southern杂交

或点杂交使用克隆基因作为探针，无须特殊试剂

通过信号强弱间接测定每个细胞内的病毒数量需从病毒储存液中额外扩增，整个流程需要一周时间 仅能检测克隆的基因

PCR迅速，使用扩增病毒的储存液只需1天时间仅能检测克隆的基因且无法定量 可能需要优化克隆基因的PCR条件 免疫测定相对快速，总共需要3天时间

需要与细胞蛋白无交叉反应的特异性抗体显示插入基因的蛋白表达水平

功能测定直接显示蛋白的完整性和功能需从病毒储存液中额外扩增，整个流程需要一周时间

对于大多数方法来说，信号密度与蛋白的表达水平、病毒DNA的增殖程度以及病毒保存液的纯度有关。空斑总量中的阳性率提示克隆的纯度高低。比较不同克隆间的信号密度水平时克隆的纯度非常重要，也就是说必须保证所有筛选出来的空斑必须100%阳性。

5.5.2病毒空斑挑选和小量扩增

通过AdEasyTM系统纯化得到的细菌克隆而产生的病毒空斑应该几乎都是（95%）重组病毒。每个细菌克隆最好测定至少1~2个空斑的表型。 操作步骤

1.从培养板上挑选6~12个空斑，标上圆圈。

2.无菌条件下用200μL头挑出克隆并转入含0.5mLDMEM5%/孔的24孔板。 3.37℃病毒24小时。

4.铺一块每孔含1×105QBI-293A细胞的24孔板。

5.移去培养液，轻轻加入100μL步骤3中清洗的病毒（约103病毒颗粒），切勿将细胞吹起，十字型轻轻晃动3次，转入CO2孵箱37℃培养90分钟。

6.加入DMEM5%，使总体积为1mL，轻轻混匀。

7.37℃CO2孵箱培养直至完全出现CPE，在此MOI值下一般需要5~10天。如果10天后还没出现CPE，说明此克隆的病毒量太低，需要进行第二轮扩增。

8.为从细胞中释放病毒，在-20℃和37℃中充分冻融细胞3次。

9.收集细胞，在15mL离心管中打碎。台式离心机上以最大转速离心10分钟，收集上清并储存于-80℃。这一冻存液中大约有5×107VP/mL。如步骤7中所述，如果在第一次扩增后CPE不完全，则进行第二轮扩增。

由于QBI-293A细胞含有腺病毒基因组的E1区，因此E1区缺失的腺病毒与人染色体发生同源重组而产生有增殖能力的腺病毒（RCA）的机率很低。发生这种回复突变的机率大约为1/107，这种腺病毒的增殖速度比重组腺病毒快。首轮扩增产生的腺病毒保存液是十分重要的，因为它含有RCA的可能性最低。这种保存液必须节约使用，并保存好所有低代病毒，以便进行大量扩增，不可用已传过数代的病毒进行大量扩增。低代病毒DMEM5%溶液可在-80℃条件下保存数年。所以，保存好低代病毒可避免进行重复筛选和纯化病毒克隆的工作。

在这一期间可以选择适当的方法来筛选重组病毒，当所有病毒空斑100%为正确的重组病毒时可以认为这个克隆为纯的。如果此时病毒仍然不纯，则可以进行第二轮空斑纯化，然后再用适当方法进行筛选。

以下内容提供了进行Western杂交的一般指导。按照本手册制备的初次病毒扩增保存液已足够用来检测大多数腺病毒蛋白，SDS-PAGE、抗体反应和检测系统的具体操作请参考标准实验手册。

1.在5×105细胞/孔的24孔板中每孔加入500μLDMEM5%培养液，然后再每孔加入200μL初次病毒扩增保存液感染48小时。

2.确证所有细胞均出现CPE，如果CPE不完全则再延长感染24小时。 3.取出400μL转入1.5mL试管中，其余-80℃℃孵育2小时。 5．加入5MNacl储存液至终浓度为1M。 6．冰浴3小时以上，或4℃过夜。 7．14000×g4℃℃℃。

4．800rpm离心5分钟，弃上清，将沉淀用20ulPBS重悬，用P20移液器使细胞充分混匀，重悬。

此时，可按照能保留蛋白功能的操作方法提取蛋白。注意，细胞抽提物含有大量病毒DNA，从而会提高溶液的粘滞度。如果粘稠性影响操作，可用超声降解DNA或用20G针头将DNA打碎。但细胞浆抽提物则不存在此问题。对于DNA结合蛋白，蛋白功能测定通常是观察其迁移，对某些酶则进行比色测定。 5.6病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在QBI-293A细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011~3×1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000~10000，因此1L培养细胞可得到约5×1012病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少3×108的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提（根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀）。为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。 操作步骤：

1.在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10mlDMEM5%培养5×106QBI-293A细胞。

2.取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释应得到的MOI值约为5。

3.移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃CO2孵箱中培养90分钟。 4.加入9mlDMEM5%。

5.再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5×109~5×1010个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒（5.3）。 如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定（5.8）。收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）病毒保存溶液重悬细胞。-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后按5.8进行病毒滴定。 6.-20℃/37℃冻融3次。

7.转入15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10分钟，收集上清冻存于-20℃或-80℃。 8.3个175cm2培养瓶中各加入107QBI-293A细胞进行培养。

9.将3ml细胞裂解液上清加入12mlDMEM5%中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3次，37℃CO2孵箱中培养90分钟。此时MOI值约为25。 10.加入DMEM5%至30ml。

11.再培养48~72小时。此时10ml培养液病毒量约为3×1010~3×1011。若需要，进行MOI测定（5.3）以估计病毒滴度。 此时如果病毒量已足够，则可立即进入病毒滴定步骤（5.8）。600×g离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，按5.8章中所述进行病毒滴定。 12．移入50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心10分钟，取出上清保存。 13．30瓶175cm2培养瓶中每瓶各加入107QBI-293A细胞。

14．将45ml细胞裂解液上清加入105mlDMEM5%混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3次混匀，37℃培养90分钟。此时MOI值约为25。 15．加入DMEM5%至30ml/瓶。

16．再培养48-72小时，此时约有3×1011~3×1012个病毒。若需要，进行MOI测定估计病毒滴度。

如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在5mlDMEM5%中。-20℃/37℃冻融3次，离心沉淀细胞碎片。此时5mlDMEM5%中3×1011~3×1012个病毒颗粒，浓度为6×1010~6×1011vp/ml。然后按5.8章中所述滴定病毒储存液，或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。

在109细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在1010细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞，因这会大大增加RCA产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA产量。如果已没有纯化的空斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。如果需要大于扩增4轮后的病毒量，注意请用早期的病毒作为扩增源。比如，用第2代病毒产生第3代病毒。如果没有第2代病毒，那么必须用第1代病毒来产生新的第2代病毒。按这个原则进行扩增可使RCA水平尽可能低。

如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取1-5mg蛋白，建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。 表5：腺病毒扩增

5.7两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒。 腺病毒纯化包括3步：

1．不连续氯化铯密度梯度离心去除主要的细胞污染物和缺陷性病毒颗粒。 2．连续氯化铯密度梯度离心将感染性病毒颗粒和缺陷性病毒颗粒分开。 3．透析去除氯化铯（去盐）。

连续密度梯度需要过夜离心。为保证时间安排，建议从早上开始第1步，这样大约在午后就可开始过夜离心。按照此时间安排，完整的一个纯化过程包括去盐在内大约需2天时间。

下面所有操作均以SW28转子30ml离心管为例。理论上讲，溶液体积调整后也可用其它大小的离心管，切记在离心后收集病毒带。由于有些污染物和成熟的病毒颗粒密度相近，因此这二条带之间的距离很小。在大直径的离心管中，病毒带更细，离原始位置更远，这样，病毒带在30ml离心管中比在12ml的管中更易分辨。 5.5.7不连续密度梯度离心

注意：为确保氯化铯密度梯度后较易分辨病毒带，扩增病毒至少需要3×108细胞。 1．预冷离心转子至4℃。

2．在离心管中缓慢加入8ml1.4g/ml氯化铯（53g+87ml10mMTrz-HCL，PH7.9），再非常轻缓地加入6ml1.2g/ml氯化铯26.8+92ml10mMTris-HCL，PH7.9）。病毒最终的纯度有赖于密度梯度的质量。

3．超净台中在不连续梯度顶部加入20mlDMEM5%病毒保存液，病毒量必须少于109细胞中所得的，否则将超过密度梯度负荷量。如果保存液的体积少于20ml，用PH7.910mMTris-HCL调至20ml。 4．平衡离心管，100000×g（SW28转子上为23000rpw）4℃离心90分钟。 5．超净台中取出离心管，用夹子直立固定离心管。 6．用10ml移液器从梯度顶部吸去大部分杂质。

7．在离心管外壁的穿刺点上贴上胶带，以防止在穿刺过程中有液体泄露。 8．用带18G1.4g/ml和14ml1.2g/ml氯化铯连续密度梯度加入离心管中。

3．100000×g4℃离心16-20小时。

4．超速离心后，连续梯度溶液和不连续梯度溶液同样分层，但底部没有沉淀，因此通过底部穿刺即可获得感染性病毒带。溶液上部（含细胞成分）通常更为干净，大部分细胞碎片已通过第一步不连续梯度离心被去除了。

5．用10ml移液器从离心管顶部吸去大部分梯度溶液和杂质，避免吸到底部含病毒的蓝白色条带。这有助于在收集病毒时降低溶液流出速度。

6．用20 G10mMTris（PH8.0），2mMMgcl2，5%蔗糖的病毒缓冲液可允许病毒浓缩至1013vp/ml，并且具有良好的稳定性。（Nyberg-Hoffman等，1999）。

将病毒带在分子筛为25000道尔顿的纤维素酯膜中进行4℃透析，去除氯化铯盐。由于病毒分子量较大，大小约90nm，因此不能穿过透析膜。缓冲液的体积应为病毒溶液的200倍，每次透析一小时，然后更换缓冲液，3次更换缓冲液后应已无痕量氯化铯。透析后的病毒溶液可在-80℃中长期保存，-20℃中则可保存较短时间。需要注意的是腺病毒在反复冻融后感染力将减弱，因此可将病毒分装成小份，一部分进行滴度测定（5.8：病毒滴度测定），剩下的用于以后的实验。如果透析后病毒溶液太稀，Millipore公司的超纯浓集柱可将病毒浓度提高10倍。这个过程中所丢失的病毒量小于10%。纯化柱在使用前必须用70%乙醇消毒，然后在加入病毒前再去除痕量乙醇（比如用病毒缓冲液）。 5.8病毒滴度测定 有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。

1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）

2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似） 3．PFU（空斑形成单位）

4．TCID50（50%组织培养感染剂量）

不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。 1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。

2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。

3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。

4．TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。

所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。这两个实验室所得到的结果更为稳定，并证实以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。迄今为止，尚无一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。 对于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的结果往往相差100倍以上，典型的数据见表6。所有结果都只是大概的，目前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到1个感染性颗粒/2个颗粒。

下一部分，我们将详细描述3种不同的测定病毒滴度的方法。选择滴定方法要考虑的关键因素包括可重复性、稳定性、敏感性、易用性和耗时。无论选择那种方法，稀释和滴定过程必须重复操作以得到精确结果。一般来说，用TCID50方法得到的病毒保存液的滴度应为： 106~107第一代细胞经冻融后 108~109100倍数量的细胞经过冻融后 1010~1011用氯化铯方法纯化后 表6：各滴度测定方法特性 方法类型时间可重复性滴度*评注 VP物理学方法2小时好5×1012 GTU生物学方法2天可变2×1011

PFU生物学方法21天变化很大5×1010传统方法

TCID50生物学方法10天可变2.5×1011昆腾公司标准方法 *以VP法测得的5×1012的病毒保存液为标准 5.8.1

这种方法只是通过DNA量来表示病毒滴度。相关系数为1.1×1012/OD260单位。由于大多数分光光度计在OD值小于0.1时不够精确，而样品准备过程中又至少要稀释10倍，因此如果OD值大于0.1，我们可以估计病毒量大于1012。这一方法只可用于测定氯化铯纯化后溶于缓冲液中的病毒，因含血清培养基会干扰吸光度。同时，它也要求病毒浓度足够高，并且不含缺陷性颗粒。 1．4℃融化病毒保存液。

2．在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB）（0.1%SDS，10mMTrisPH7.4，1mMEDTH）准备二个病毒稀释度。 最小需要量为：病毒裂解液病毒稀释度 52ul52ul1：2（稀释液1） 168ul42ul1：5（稀释液2）

注意：病毒滴度高时（1013/ml）用1：10和1：20稀释度，滴度低时用低稀释度，保证OD值在0.1~1.0之间。 3．56℃震荡培养10分钟。

4．准备1ml含有VLB和透析缓冲液的空白对照溶液，比例同上，以缓冲液代替病毒裂解液。 5．测定260nm处吸光值：

稀释液1再稀释1：5，为稀释液3。

稀释液2再稀释1：5和1：10，分别为稀释液4和稀释液5。

测定稀释液5（2次）、4、3的OD260，取此4值的平均值作为最终结果。 例如

1．将450ulVLB和50ul稀释液即透析缓冲液加入比色杯中。 2．记下空白管读数后弃去，不要冲洗。

3．加入450ulVLB和50ul1：5稀释样本（稀释液2），组成稀释液5。 4．记下读数后弃去。

5．清洗比色杯，加入样本重复测一次。

6．清洗比色杯，加入400ulVLB和100ul1：5稀释空白液。 7．记下空白管读数后弃去，不要清洗。

8．加入400ulVLB和100ul1：5稀释样本，组成稀释液4。 9．记下读数后弃去。

10．清洗比色杯，加入400ulVLB和100ul1：2稀释空白液。 11．记下空白读数后弃去，不要清洗。

12．加入400ulVLB和100ul1：2稀释样本，组成稀释液3。 13．记下读数后弃去。

将吸光值与稀释度相关系数相乘即可得出病毒滴度： OD260×病毒稀释度×测定稀释度×1.1×1012=OPU/ml

空法斑法测定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果，因此这一方法得到的结果往往最不稳定。

1．5×105细胞/60mm培养皿用5mlDMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。

2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。

稀释：将100ul病毒保存液加入900ulDMEM5%。用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。换用新头将300ul10-1稀释液加入2.7mlDMEM5%，上下吸打5次，稀释度为10-2。然后分别取300ul前一稀释液加入2.7mlDMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。 注意：每次稀释时都必须换用新头。

3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1mlDMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。

5．37℃-293A细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。

1．收集一瓶QBI-293A细胞，计数。 2．用DMEM2%准备20ml105/ml细胞。

3．用12道排在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。

1．第1管中加入0.9mlDMEM2%，其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。 2．上下吸打5次混匀。 3．换用新头。

4．从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。 5．反复稀释至最高稀释度。

6．用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。

7．最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。阴性对照孔中加入0.1mlDMEM2%监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。 8．37℃培养10天。

9．10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。

10．计算每一排中出现阳性的孔数。

如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100% 阴性，则本测试即为有效。 图7：TCID50的典型结果

稀释度10-10；10-9；10-8；10-7；10-6；10-5；10-4；10-3 孔124567101112对照：：CPE阳性：CPE阴性

结果（每排阳性比率）：稀释度与比率分别为：10-100/10=0；10-90/10=0；10-82/10=0.2；10-76/10=0.6；10-610/10=1；10-510/10=1；10-410/10=1；10-310/10=1

在这一例子中，当稀释度为10-6时出现100%阳性，当稀释为10-9时出现0%阳性。因此，滴度可以用KARBER统计法精确算出：对于100ul的稀释液，滴度为T=101+d（s-0.5） d=log10稀释度=1（对于10倍的稀释度而言）

s=阳性比率之和（从第1个10倍稀释度开始）=1+1+1+1+1+1+0.6+0.2+0+0=6.8。

虽然一些低稀释度在测定中省略了（如10-1和10-2），但在计算时仍应以阳性比率为1来算。 滴度：T=101+1（6.8-0.5）=107.3（100ul病毒保存液中） T=100.3≈2×108TCID50/ml。

说明：我们已经证实，TCID50法测到的滴度d=log10值比标准空斑法高0.7。 将TCID50/ml转换为PFU/ml：

T=1×108.3TCID50/ml=1×108.3-0.7PFU/ml=1×107.6PFU/ml≈4×107PFU/ml。 两次重复试验得到的滴度值应相差≤0.7个log10值（100.7）。

第六章疑难解答

6.1QBI-293A细胞培养 表现可能原因解决方法

细胞高死亡率/细胞脱壁/培养液发黄支原体、细菌或酵母菌污染1）复苏一管新的细胞 2）使用抗生素如链霉素和青霉素

细胞生长困难a)细胞太少QBI-293A细胞传代时至少为5%汇合率，以保证其在一定时间内恢复生长 b)细胞密度过高QBI-293A如果经常培养密度过高，则有产生突变的危险，细胞汇合率切勿超过70% 6.2感染力测定 表现可能原因解决方法

感染后细胞高死亡率a）MOI过高降低MOI

b）细胞内含有内源性病毒（野生型腺病毒可产生辅助病毒样作用，使非重组腺病毒也能感染细胞）更换冻存的细胞，初代培养的较适用

c）一些细胞株有类似E1区活性若一定要使用该细胞株,改用较低MOI

不感染a)MOI太低1)尝试不同范围MOI。对于293之外的细胞株，MOI一般为1~200，对于某些难于感染的细胞株可能需要更高

2)如果使用的是Infect+阳性对照，储存液在应用之前首先应扩增 b)感染条件不够优化1）任何感染试验都需以293细胞为阳性对照 2）以未感染的293作为阴性对照来监测细胞培养条件

c)一些细胞可拮抗腺病毒的感染,需要很高MOI联系技术支持（infoqbi.com） 6.3转移载体克隆

表现可能原因解决方法

转化大肠杆菌后无菌落形成a）抗生素应用不当b）转化效率差c）制备的质粒质量差使用50ug/ml卡那霉素

确证细胞是否具有转化活性；用氯化铯或其它方法纯化质粒；转化后有太多菌落形成培养基中无抗生素培养基中加入卡那霉素

筛选的克隆中无目的基因a）不匹配粘末端连接；b）钝末端连接导致无转化；c）连接头太短，不能被有效切割；d）Taq酶在PCR片段末端产生太多突出性腺嘌呤确证酶切后DNA粘末端是否匹配 加大连接酶量，确证克隆位点已正确应用，Klenow进行钝化

确证连接头之间有足够的碱基对以供正确酶切。详细信息可向内切酶供应商查询

Taq酶在PCR产物3’末端可产生一个额外的腺嘌呤。必须移去这个额外的腺嘌呤（可用Klenow）或者使用产生钝末端的温度稳定性聚合酶

转移载体重组子的分子量不正确使用了错误的载体或克隆基因cDNA用胶纯化，确保连接前无其它载体污染

性内切酶无法切割质粒a）甲基化b）酶已失活，检验切割的序列是否对甲基化敏感，若是，则在对甲基化不敏感的细菌如GM33中扩增质粒使用新鲜的酶和制造商推荐的缓冲液 6.4在BJ5183细胞转化和重组 表现可能原因解决方法

菌落少或无菌落a)转化效率不够；b)抗生素使用错误或浓度过高；c)制备的质粒质量差；d)细胞转化活性 e)使用了错误的细菌株1）按照试验盒说明书进行操作，这是一个关键步骤，必须使用最优条件 2）向电穿孔仪制造商查询适用于这一细胞的特定操作方法 抗生素为50ug/ml卡那霉素 1）用氯化铯或其它方法纯化质粒

2）胶纯化可降低背景菌落的形成，但也可能降低了转化效率。当转化效率太低时避免使用胶纯化

1）试剂盒中提供的细菌都具有电穿孔转化活性，如果使用其它方法进行转化，则必须将细胞制备为化学转化活性 2）细菌必须正确保存以免丧失转化活性，参照推荐的方法保存

使用试剂盒中提供的BJ5183细菌株，DH5α仅供用于重组子的扩增，因其无重组活性。 菌落过多a)转移载体和病毒DNA的比率过高 b)转移载体用PmeI线性化不完全

c)卡那霉素质量差或量不够1）PmeI消化后用胶纯化或去磷酸化质粒

2）共转染时减少转移载体的量，推荐比率为：1ug转移载体:0.1ug超螺旋DAdEasy-1DNA PmeI酶切时减少DNA量，检查内切酶是否具有活性，使用新鲜的卡那霉素，浓度为50ul/ml 6.5转染QBI-293A细胞 表现可能原因解决方法

无空斑a）制备的质粒质量差用氯化铯密度梯度法纯化用于转染的质粒；b）时间问题弃去培养板之前先等2~3周或更长。空斑将在2~3周内逐渐形成，如果重组子高表达蛋白，这个过程将更慢；c）转染操作用阳性对照来检验转染效率 d）细胞拮抗腺病毒从细胞库中复苏另一管细胞

e）病毒质粒未经PacI线性化闭环质粒不会形成病毒空斑，转化前必须用PacI进行线性化

空斑太多高转染效率导致空斑密度过高由于太多数被转染细胞都将产生病毒空斑（79.5%），转染时请使用较少量的腺病毒DNA

转染后细胞高死亡率a）转染后钙离子未彻底去除转染后先后用PBS/EDTA和PBS各洗一遍，去除钙离子

b）转染后细胞经胰酶消化细胞在转染后非常脆弱，极易从壁上脱落。不要使用胰酶进行消化，这样做不仅不必要，而且还可能导致活着的细胞死亡，覆盖的琼脂糖不清澈琼脂糖被污染使用无菌的琼脂糖 6.6筛选和测定 表现可能原因解决方法

无重组子a）挑中了背景空斑（即首先出现或最大的空斑）挑空斑之前先等14~17天

b）达到或超过了载体的最大克隆能力确认是否超过最大克隆能力；若有疑问请联系技术支持（）

c）插入基因产物有毒在293细胞中暂时性表达蛋白以评价气度性。若有毒，请替换未可诱导或较弱的启动子 d）插入基因缺失重组时因某些未知原因可能导致基因缺失，应筛选较多的克隆

扩增后插入基因丢失有RCA，当大量扩增时可能发生回复突变1）检测是否含有RCA或感染非允许细胞

2）联系技术支持，请教如何检测和这一现象 3）用原始病毒保存液重新空斑纯化病毒

重组时将插入基因丢失用原始病毒保存液重新扩增 6.7在QBI-293A细胞中表达 表现可能原因解决方法

重组蛋白不表达a）基因未插入重组病毒用病毒保存液进行PCR反应，检测是否含有目的基因 b）表达水平太低，所用方法无法检测到优化检测蛋白表达的条件

蛋白表达水平太低a）蛋白表达的克隆设计不够优化，如非翻译区太长、离启动子太远等等选择最佳蛋白表达克隆。这些因素在进行克隆设计时就应考虑到

b）启动子不太适合在所用的细胞类型中表达蛋白用另一类型细胞验证蛋白表达情况 6.8重组腺病毒的扩增 表现可能原因解决方法

病毒溶液终浓度低病毒增值速度慢，这和很多因素有关，如插入基因的大小、毒性和重组情况等等1）感染时间从48小时增加到72小时，以产生完全的CPE 2）保证三次冻融都很完全

3）如果需要，用更大的培养器皿和更多的细胞进行更大量的扩增（代数不能太多） 6.9纯化

表现可能原因解决方法

第一次氯化铯离心后无条带形成a）收集的细胞量太少

b）病毒量太多1）感染的细胞量不够。至少需要3×108细胞，当病毒生长缓慢时则需更多细胞 2）降低稀释度

上样量密度过大将使分离失效，适当稀释上样液

第二次氯化铯离心后无条带形成第一步操作不当导致病毒丢失吸取病毒带时必须非常小心，宁可吸到污染的杂质也不要漏吸，第二步将会去除污染的缺陷性颗粒

第二次离心后条带分离不清晰a)氯化铯密度梯度制备质量差

b)离心问题1）连续密度梯度必须使用密度梯度发生器小心制备，离心前切勿将梯度打乱 2）稀释第一步中得到的病毒带

3）不要使用直径比推荐值小的离心管，否则条带将变大 检查离心记录，速度和时间都会影响分离效果 6.10病毒滴度测定 表现可能原因解决方法

OD260测得的滴度与空斑测定或TCID50测定获得的滴度无相关性a）含有大量缺陷性颗粒b）稀释错误；

c）细胞密度不够用两次氯化铯离心纯化病毒，去除缺陷性颗粒，精确测定滴度时，每个稀释度都应有复孔；稀释时必须换用头；进行滴度测定时细胞必须50~60%汇合

无CPE或空斑a）保存液滴度太低，无法检测到；b）时间问题1）使用阳性对照，以确保方法和溶液的有效性 2）降低保存液的稀释度

在推荐时间内等待空斑形成和CPE出现

保存后滴度降低缓冲液不对或储存不当1）使用含2mMgcl2和5%蔗糖的10mMTris缓冲液，PH8.0，PH值对于长期保存至关重要

2）将病毒保存于-80℃，不主张长期保存于-20℃；3）将病毒分装成小份，以免反复冻融后降低滴度