%9a%84人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用

胡永亮

刘真

焦大凯

马恬

王常勇

贾赤宇

目的　观察ＴＧＦ－［１对人皮肤成纤维细胞表型转化的作用是否受到ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶　　信号通路的影响，以探究该通路是否参与了人皮肤成纤维细胞的表型转化。方法　原代培养人皮　　肤成纤维细胞，将第４代细胞用ＴＧＦ－β１（　１０　ｎｇ／ｍｌ）刺激后，分不同作用时间（０、３、６、２４ｈ）提取细胞　　内总蛋白。ＢＣＡ法测定总蛋白浓度，Ｗｅｓｔｅｒｎ　－ｂｌｏｔ检测α－ＳＭＡ的表达水平；并用相同的方法检测不　　同浓度ＴＧＦ－β１（０、２、１０、５０　ｎｇ／ｍｌ）刺激人皮肤成纤维细胞后，α－平滑肌肌动蛋白（α－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　　　ａｃｔｉｎ，α－ＳＭＡ）的表达水平。用ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路阻断剂Ｙ－２７６３２处理后，再用ＴＧＦ－β１刺激，　　作为实验组，将未作处理的正常细胞作为空白对照组，Ｙ－２７６３２（１０　μｍｏｌ／Ｌ）组作为阴性对照组，只　　用ＴＧＦ－β１（　１０　ｎｇ／ｍｌ）刺激组作为阳性对照组，分别检测α－ＳＭＡ的表达差异。使用ＡＮＯＶＡ对蛋白　　表达量进行统计学分析，Ｐ　＜０．０５为差异有统计学意义。结果　　１０　ｎｇ／ｍｌ　ＴＧＦ－β１按不同作用时间　　刺激人皮肤成纤维细胞后，α－ＳＭＡ的表达量分别为：０ｈ为１．０，３ｈ为１．９＋０．２、６ｈ为２．１±０．１，　　２４　ｈ为３．１±０．１。２４　ｈ较其他３个时间点α－ＳＭＡ表达量明显上升（ｎ＝４，Ｐ＜０．０５）。不同浓度　　ＴＧＦ－β１刺激人皮肤成纤维细胞后，α－ＳＭＡ的表达量分别为：０　ｎｇ／ｍｌ为１．０，２　ｎｇ／ｍｌ为１．４±０．２，　　１０　ｎｇ／ｍｌ为３．２±０．１，５０　ｎｇ／ｍｌ为３．１±０．２。１０　ｎｇ／ｍｌ表达量明显高于０　ｎｇ／ｍｌ和２　ｎｇ／ｍｌ（ｎ　＝４，　　Ｐ　＜０．　０５），较５０　ｎｇ／ｍｌ差异无统计学意义（ｎ＝４，Ｐ＞０．０５）。用Ｙ－２７６３２（１０　μｍｏｌ／Ｌ）处理后，再用　　ＴＧＦ－β１刺激，细胞的表型转化明显受到抑制，实验组α－ＳＭＡ的表达量（１．２±０．２）较阳性对照组　　（２．９±０．１）明显降低（ｎ＝５，Ｐ　＜０．０５），与空白对照组（１．０）和阴性对照组（１．１±０．１）相比差异均　　无统计学意义（ｎ＝５，Ｐ＞０．　０５）。结论　ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路参与了　ＴＧＦ－β１诱导的人皮肤成纤　　维细胞表型转化过程。

成纤维细胞；　　ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路；转化生长因子β１；　　α－平滑肌肌动蛋

白

Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｎ　ＴＧＦ－β１－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　

ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ＨＵ　Ｙｏｎｇ－ｌｉａｎｇ

ＬＩＵ　ＺｈｅｎＪＩＡＯ　Ｄａ－ｋａｉＭＡ　ＴｉａｎＷＡＮＧ　Ｃｈａｎｇ－ｙｏｎｇ

ＪＩＡ　Ｃｈｉ－ｙｕ

Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　ａｎｄ　Ｂｕｒｎ　Ｒｅｐａｉｒ，　３０９　ｔｈ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　ＰＬＡ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ　　１０００９１，　Ｃｈｉｎａ　

Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　　　Ｔｏ　ｅｘａｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｎ　ＴＧＦ－β１－

ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　　Ｔｈｅ　４ｔｈ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＴＧＦ－β１　（１０　ｎｇ／ｍｌ）．　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　α－ＳＭＡ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ＴＧＦ－β１　ｆｏｒ　０，　３，　６，　ａｎｄ　２４　ｈ．　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔ－ＳＭＡ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　

ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＧＦ－β１　（０，　２，　１０，　５０　ｎｇ／ｍｌ）．　　Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　

ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　（４ｔｈ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）　ｗｅｒｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＴＧＦ－３１　（　１０　ｎｇ／ｍｌ）　ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｙ－２７６３２　（ｌ０ｕｍｏｌ／ｍｌ）．　　Ｔｈｅ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｏｔｈｉｎｇ　ａｓ　

ｓｈａｍ　ｃｏｎｔｒｏｌ，　ｏｒ　ｗｉｔｈ　Ｙ－２７６３２　（１０ｕｍｏｌ／Ｌ）　ｏｎｌｙ　ａｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，　ｏｒ　ｗｉｔｈ　ＴＧＦ－β１　（１０　ｎｇ／ｍｌ）　

ｏｎｌｙ　ａｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　α－ＳＭＡ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ａｌｌ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐｓ．　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　

１０．　３７６０／ｃｍａ．　ｊ．　ｉｓｓｎ．　１００９－４５９８．　２０１１．０５．　０１５

国家自然科学基金（３０７７２２５９）

　　　　作者单位：１０００９１　北京，第３０９医院整形美容烧伤修复中心（胡永亮、刘真、马恬、贾赤宇）；军事医学科学院基础医学研究所组织

工程研究室（王常勇）；航空工业中心医院整形外科（焦大凯）

万方数据ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡＮＯＶＡ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　　　α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｗｉｔｈ　１０　ｎｇ／ｍｌ　ＴＧＦ－β１　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　０，　３，　６，　２４　ｈ　ｗａｓ　１．０，　１．９　＋０．２，　２．　１　＋０．　１，　３．１　＋０．　１，　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，　α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　２４　ｈ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｔｈｒｅｅ　ｇｒｏｕｐｓ　（　ｎ　＝　４，　Ｐ　＜　０．　０５　）．α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＧＦ－β１　（　０，

２，　１０，　５０　ｎｇ／ｍｌ）　ｗａｓ　１．０，　１．４　±０．　２，　３．２　±０．　１，　３．１　±　０．　２，　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，　α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　１０　ｎｇ／ｍｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　２　ｎｇ／ｍｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　（　ｎ　＝　４，　Ｐ　＜　０．　０５　）．　Ｔｈｅｒｅ　

ｗａｓ　ｎｏ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　１０　ｎｇ／ｍｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　５０　ｎｇ／ｍｌ　ｇｒｏｕｐ　（ｎ　＝４，　Ｐ　＞０．　０５　）．　Ｗｉｔｈ　ｂｏｔｈ　Ｙ－２７６３２　（１０　μｍｏｌ／Ｌ）　ａｎｄ　ＴＧＦ－β１　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ．　α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　（　１．２　±　０．　２　）　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｒｅｄｕｃｅｄ，　ｗｈｅｎ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　（　２．　９　±　０．　１　）　（　ｎ　＝　５，　Ｐ　＜　０．　０５　）．　Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　

（　ｎ　＝　５，　Ｐ　＞　０．０５　）　ｉｎ　α－ＳＭＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　（　１．０　）　ａｎｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　（　１．１　±

０．　１　）．　　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　　　　ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ＴＧＦ－β１－ｉｎｄｕｃｅｄ　

ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．

Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；　　　ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｐａｔｈｗａｙ；　　　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ１　；

α－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ　

万方数据・３７８・史！￡鳖丝丛ｉ±盘查！！！！篁！旦笙！！鲞箜！塑￡！ｉ！：！！堕！！！！些！！！Ｐ：垫！！！∑！！：！！！盟！』缓冲液清洗２遍，然后用细胞裂解液ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（１０ｍｍｏＬ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００、１０ｎｇ／ｍｌＡｐｒｏｔｉｎｉｎ、２ｕｇ／ｍｌＬｅｕｐｅｐｔｉｎ、ｌｍｍｏｌ／Ｉ．ＰＭＳＦ）裂解细胞，冰卜孵育１５ｍｉｎ。将裂解物进行离心１２０００ｒ／ｒａｉｎ，离心半径７ｃｍ，４℃，１０ｒａｉｎ，将卜－清分离到Ｉ．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中。用ＢＣＡ法测定蛋白浓度，最后制备电泳样品，一２０℃冻存。１．２．６Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ：取细胞总蛋白电泳样品（０【一ＳＭＡ：总蛋白１斗ｇ，１０％ＳＤＳＰＡＧＥ；ＲｈｏＡ：总蛋白１０ｕｇ，１２％ＳＤＳＰＡＧＥ）ＳＤＳＰＡＧＥ。再将凝胶上的蛋白用半干法电转至ＰＶＤＦ膜上，５％脱脂奶粉４℃封闭过夜，分别选用０【一ＳＭＡ一抗１：３０００，Ｂ．ａｃｔｉｎ一抗１：４０００；用ＴＢＳＴ洗３次，每次１０ｍｉｎ。山羊抗鼠二抗ｌ：１００００，各室温孵育ｌｈ，用ＴＢＳＴ洗３次，每次１０ｒａｉｎ。洗涤后的膜用ＷｅｓｔｅｒｎＲｌＭ一～～１ＥＣＬＬ｜｜ｊ｜｜ｊ｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜发光剂室温下反应５ｍｉｎ，最后暗室曝光成像。１．２．７统计学方法：用软件ＩｍａｇｅＪ１．４２分析数据，统计表达差异，得出结论。使用ＡＮＯＶＡ进行统汁学分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。２结果２．１不同时问ＴＧＦ—Ｂ，对人皮肤成纤维细胞表型转化的影响１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ—ｐ．按不同作用时间刺激人皮肤成纤维细胞后，ｄ．ＳＭＡ的表达量分别为：０ｈ为１．０，３ｈ为１．９±０．２，６ｈ为２．１±０．１，２４ｈ为３．１４－０．１。用１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ—ｐ．处理人皮肤成纤维细胞３ｈＡ，仪一ＳＭＡ的表达量明显升高，２４ｈ后达到所检测时问段的最高值。２４ｈ较０、３、６ｈ仪一ＳＭＡ表达量明显上升（ｎ＝４，Ｐ＝０．００，Ｐ＝０．０１，Ｐ＝０．０１，图１）。这表明１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ—Ｂ。刺激２４ｈ能够成功诱导人皮肤成纤维细胞向肌成纤维绌胞的表型转化。２．２不同浓度ＴＧＦ—ｐ．对人皮肤成纤维绌胞表型转化的影响用２ｎｇ／ｍｌＴＧＦ—Ｂ．处理人皮肤成纤维细胞２４ｈ后，ｄ—ＳＭＡ的表达量明ｊＩＩｊ．升高。用１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ—Ｂ．处理细胞２４ｈ后，仪一ＳＭＡ的表达量（３．２±０．１）较０和２ｎｇ／ｍｌＴＧＦ—Ｂ．（１．４±０．２）均明显升高（ｎ＝４，Ｐ＝０．００，Ｐ＝０．００），而较５０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ—ｐｌ（３．１±０．２）无明显变化（，｝＝４，Ｐ＝０．２３，Ｐ＞０．０５，图２）。这表明１０ｎｇ／ｍｌ是ＴＧＦ—Ｂ．对人皮肤成纤维细胞刺激２４ｈ后诱导表型转化的比较合适的浓度。２．３ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶（ＲＯＣＫ）通路参与人皮肤成纤万方数据＿—＿●●—一。““…，ｑｌｎｉｌｌＤ，ｉｌＵＤ嘲—鞠—謦胡——嘲—Ｉ删蚓描兰２叩３６２４ｆｈ图１１０ｎｇ／ｍｌＴＧＩ＇１一Ｂ．在，ｆｉ同时间段刺激人皮肤成纤维细胞后，Ⅱ一ＳＭＡ的表达：２４ｈｄ—ＳＭＡ的表达量明显高丁０、３、６ｈ（，ｏ＝４．Ｐ（０．０５）Ｆｉｇ１Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ０【一ＳＭＡａｆｔｅｒＩｒｅａｔｍｅｎｌｗｉｔｈ０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ・ｐｌ：Ｏｔ—ＳＭＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ２４ｈｇｒｏｕｐＷｆｌＳｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎ０，３，６ｈｇｒｏｕｐｓ（ｎ＝４，Ｐ＜０．０５）阻ｔｅｌ…＿—嘲—■－嘲＿—＿—－州■—●■簟嘲————＿ｎ二Ｉ（）‘（ｊ｛１１女ＩＩ＇ｉｌ—捌蚓揣《三叩∑；／－｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜ｊ｜｜｜｜｜｜¨ｌ主堡墼墅处塾苤查！！！！至！旦箜！！鲞箜！塑垦蔓！！！些！！竺堡！！望：！！！！！！！！：！！！型！：！『．－－‘一一｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜刺激，细胞的表型转化明显受到抑制，实验组ｏ【一ＳＭＡ的表达量（１．２４－０．２）较阳性对照组（２．９－４－０．１）明显降低（／／，＝５，Ｐ＝０．００，Ｐ＜０．０５），与空白对照组（１．０）和阴性对照组（１．１４－０．１）相比均无明显差别（ｎ＝５，Ｐ＝０．１０，Ｐ＝０．１５，图３）。该结果表明，Ｙ．２７６３２通过对ＲＯＣＫ的作用抑制了ＴＧＦ—Ｂ，对人皮肤成纤维细胞ｄ—ＳＭＡ的诱导表达，ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路参与了ＴＧＦ．Ｂ。诱导人皮肤成纤维细胞表型转化过程。“一ＳＭＡ糨８鞠№晦“皤期簟—嗣参＿——＿≯１５－ａｃｔｉｔ，嘲——■觏———■阏—簟—簟镧■——擘空白对照Ｙ－２７６３２１＇ＧＦ・Ｂ５－２７６３２＋ＴＧＦ—Ｄ－－１—１ｊ－ｌ图３用ＲＯＣＫ抑制剂１０ｐ。ｍｏｌ／ＬＹ－２７６３２和１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ—ｐ。共同处理人皮肤成纤维细胞２４ｈ后．０【一ＳＭＡ的表达量较阳性对照组（ＴＧＦ－ｐＩ）明显降低（ｎ＝５，Ｐ＜０．０５），与空白对照组和阴性对照组（Ｙ－２７６３２）相比差异均无统计学意义（ｎ＝５，Ｐ＞０．０５）Ｆｉｇ３Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ“一ＳＭＡｉｎｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＲＯＣＫ１０Ｉ．ｚｍｏｌ／ＬＹ一２７６３２ａｎｄ１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ—ｐｆｏｒ２４ｈｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｅｓｓｔｈａｎｔｈａｔｉｎｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ＴＧＦ－Ｂｌ，ｎ＝４，Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ｎ＝５，Ｐ＞０．０５）ｉｎａ—ＳＭＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ｎ＝５，Ｐ＞０．０５）３讨论目前认为，成纤维细胞生物学功能异常是瘢痕形成的最主要因素。近来，人们开始关注调节皮肤肌成纤维细胞生物学行为的信号通路。初步研究发现，肌成纤维细胞的分化有多种可能的机制，如丝裂原活化蛋白激酶和肌球蛋白轻链磷酸酶Ｒｈｏ／Ｒｈｏ激酶通路‘７。。肌球蛋白轻链磷酸酶ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶通路是细胞外信号导致细胞骨架重组的分子开关，其与肌成纤维细胞收缩的关系已经引起人们的关注，并且多集中于对该通路在皮肤损伤后肌成纤维细胞迁移方面的研究。８。９１。然而，对于人皮肤成纤维细胞在向肌成万方数据纤维细胞转化时的具体发生机制尚未阐明。ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶通路在细胞信号转导中具有重要作用，其关键分子Ｒｈｏ激酶为一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是目前研究得最清楚的Ｒｈｏ下游信号分子。小分子ＲｈｏＧＴＰ酶家族具有广泛的生物学功能，除了对细胞骨架重排有重要作用外，亦参与调节细胞的局部黏附、迁移、聚集、巨噬细胞吞噬功能等，ＲｈｏＧＴＰ酶还可能参与调节细胞增殖和基因转录¨ｏｏ。ＲｈｏＡ是小分子ＲｈｏＧＴＰ酶家族中重要的一员，Ｒｈｏ激酶则是ＲｈｏＡ最具特色的效应因子，而且是ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路的关键因子。近几年的研究发现，Ｒｈｏ／Ｒｈｏ激酶通路可能参与血管平滑肌细胞、心肌成纤维细胞的表型转化｜１“，提示该通路在成纤维细胞的表型转化过程中具有重要作用。我们的研究利用从正常组织分离的原代人皮肤成纤维细胞，在体外经ＴＧＦ—Ｂ。诱导成功转化为肌成纤维细胞，表现为细胞仪一ＳＭＡ表达水平上升；并初步探索了较为稳定的刺激时间和药物浓度，结果表明１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ—ｐ。刺激２４ｈ能够成功诱导人皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型转化。我们利用实验得出的诱导条件构建人皮肤成纤维细胞表型转化模型，并利用ＲＯＣＫ抑制剂Ｙ一２７６３２（１０ｕｍｏｌ／Ｌ）阻断ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶通路，成功抑制了细胞的表型转化。结果证实，ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶通路参与了人皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的过程：该通路不仅参与了皮肤损伤后肌成纤维细胞的迁移过程，还参与了皮肤成纤维细胞的表型转化过程。我们将在此基础上进一步探究ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶通路在人皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的过程的具体作用环节，为阐明瘢痕挛缩的分子机制并最终提出临床治疗的新思路提供一定的依据。参考文献［１］ＳａｍｐｓｏｎＮ，ＫｏｚｉｅｌＲ，ＺｅｎｚｍａｉｅｒＣ．ＲＯＳｓｉｇｎａｌｉｎｇｂｙＮＯＸ４ｄｒｉｖｅｓｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－－ｔｏ—－ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｄｐｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｒｏｍａ．ＭｏｌＥｎｄｏｅｒｉｎｏｌ，２０１１，２５（３）：５０３－５１５．［２］ＤａｒｂｙＩＡ，ＨｅｗｉｔｓｏｎＴＤ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇａｎｄｆｉｂｒｏｓｉｓ．ＩｎｔＲｅｖＣｙｔｏｌ，２００７，２５７（６）：１４３—１７９．［３］ＨｉｎｚＢ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｄｕｒｉｎｇｔｉｓｓｕｅｒｅｐａｉｒ．ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ，２００７，１２７（３）：５２６－５３７．［４］ＨａｒｖｅｙＫＡ，ＰａｒａｎａｖｉｔａｎａＣＮ，ＺａｌｏｇａＧＰ．ＤｉｖｅｒｓｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈＲｈｏｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２００７，２１１（２）：３５３．３６３．电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引过程中细胞周期蛋白表达的影响

吴国平

李绍兰

胡纯兵

刘震

高志丹何小川

尹康

郭力

目的　探索电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引成骨过程中细胞周期调节蛋白表　　达的影响。方法　４５只新西兰大白兔，双侧下颌骨截骨后３ｄ开始以０．８　ｍｍ／ｄ速度行下颌骨牵　　引，连续牵引７ｄ后，随机分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ５组，每组９只，分别在牵引区注射２μｇ（０．１　μｇ／μ１）重　　组质粒ｐｌＲＥＳ－ｈＶＥＧＦ１６５－ｈＢＭＰ２、ｐＩＲＥＳ－ｈＢＭＰ２、ｐｌＲＥＳ－ｈＶＥＧＦ１６５、空质粒ｐＩＲＥＳ和相同剂量的生理　　盐水后，均施加电穿孔刺激。各组分别于固定期第７、１４、２８天处死动物取材，行免疫组织化学检查　　细胞周期蛋白Ｃｙｃｌｉｎｓ　Ａ、Ｄ１、Ｅ的表达情况，并利用ＣＭＩＡＳ－２００１Ａ病理图像分析系统分析，结果采用　　单因素方差分析和ｑ检验。结果　Ｃｙｃｌｉｎ　Ａ、Ｄ１、Ｅ主要在肉芽组织中的炎性细胞如单核细胞、成纤　　维细胞及少量沿牵张方向排列的新生幼稚骨小梁表面的成骨细胞、骨细胞和骨周围结缔组织中表　　达；固定７ｄ时表达最强烈，１４　ｄ下降，２８　ｄ时表达较弱。图像分析结果显示，固定７ｄ时Ｃ组阳性　　表达蛋白的吸光度Ａ值（０．５９　＋０．　１４）表达较强，与Ａ（０．４１±０．　１３）、Ｂ（０．　３８　＋０．１４）、Ｄ（０．　３４±　　０．１２）、Ｅ（０．　３１　＋０．　１０）组比较差异有统计学意义（Ｐ　＜０．　０５，Ｐ＜０．　０１）；Ａ、Ｂ组间比较差异无统计学　　意义（Ｐ＞０．０５），但与Ｄ、Ｅ组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；固定１４　ｄ和２８　ｄ时，Ａ（０．　３９±　　０．１１）、Ｂ（０．　３４±０．１０）、Ｃ（０．　３３　＋０．０９）组间比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），但与Ｄ（０．　１９±０．１２）、Ｅ（０．　１４　＋０．　０４）组比较差异有统计学意义（Ｐ　＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。各时相点基因治疗组明显　　强于对照组。结论　电穿孔介导的基因治疗能使细胞周期蛋白ＣｙｃｌｉｎｓＡ、Ｄ１、Ｅ在牵引区的表达增　　强、时限延长，可能促进细胞的增殖与分化，促进牵引区细胞基质的形成和新骨生成。

电穿孔；　　基因疗法；　　骨生成，牵张；　　细胞周期蛋白

Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｃｌｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍａｎｄｉｂｌｅ　

ｄｉｓｔｒａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔ　

ＷＵ　Ｇｕｏ－ｐｉｎｇＬＩ　Ｓｈａｏ－ｌａｎＨＵ　Ｃｈｕｎ－ｂｉｎｇＬ

ＩＵ　ＺｈｅｎＧＡＯ　Ｚｈｉ－ｄａｎＨＥ　Ｘｉａｏ－ｃｈｕａｎＹＩＮ　ＫａｎｇＧＵＯ　ＬｉＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｆｆｉｌａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｌｕｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　

Ｃｏｌｌｅｇｅ．　Ｌｕｚｈｏｕ　　６４６０００，　Ｃｈｉｎａ　

１０．　３７６０／ｃｍａ．　ｊ．　ｉｓｓｎ．　１００９－４５９８．　２０１１．０５．　０１６

国家自然科学基金资助项目（　３０６００６５３），四川省应用基础研究计划项目（２００６Ｊ１３－１２８），四川省卫生厅科研课题（０６００４４，１００２８５）

６４６０００　泸州，泸州医学院附属医院整形外科

＠＠［　５　］　　　Ｈａｕｄｅｋ　ＳＢ，　Ｇｕｐｔａ　Ｄ，　Ｄｅｗａｌｄ　Ｏ．　Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ－１　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｃａｒｄｉａｃ　　　　　　　　　　ｍｉｇｒａｔｏｒｙ　ｍｅｃｈａｎｉｃｓ　ｉｎ　ｆｉｂｒｉｌｌａｒ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｍａｔｒｉｃｅｓ．　　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　

　　　　　　　　　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｂｙ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．

　　　　　　　　　Ｂｉｏｅｎｇ，　２０１０，　３　（　１　）　：７６－８３．

　　　　　　　　　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｒｅｓ，　２００９，　８３（３）：５１１－５１８．＠＠［　９　］　　Ｎｏｂｅ　Ｋ，　Ｎｏｂｅ　Ｈ，　Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｈ．　　Ｒｈｏ　Ａ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ　

＠＠［６］　　陈闻东，朱鼎良，姬开达，等．ＲｈｏＡ／ＲＯＫα反义寡核苷酸抑　　　　　　　　　ｐａｔｈｗａｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ：　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　　　　　制ＴＧＦ－β１诱导的血管外膜成纤维细胞α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ表达．中

　　　　　　　　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　Ｒｈｏ　Ａ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｃｅｌｌｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　

　　　　国分子心脏病学杂志，２００６，６（５）：２７２－２７５．

　　　　　　　　Ｃｏｍｍｕｎ，　２０１０，　３９９（２）　：２９２－２９９．

＠＠［　７　］　　Ｌｉ　Ｊ，　Ｃａｍｐａｎａｌｅ　ＮＶ，　Ｌｉａｎｇ　ＲＪ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ３８　ｍｉｔｏｇｅｎ＠＠［１０］　　郁玲玲，顾建英．Ｒｈｏ亚家族在肿瘤侵袭中的作用研究进展．

　　　　　　　　　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ１／　　　　复旦学报（医学版），２０１０，３７（５）：６１７－６１９．　　　　　　　　　Ｓｍａｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｉｎ　

＠＠［１１］　　楚玉峰，陈闻东，朱鼎良，等．ＲｈｏＡ／ＲＯＯＫ通路参与血管紧　　　　　　　　　ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．　Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ，　２００６，　１６９　（５）　：

　　　　张素Ⅱ诱导的血管外膜成纤维细胞表型转化．中华高血压杂

　　　　　　　　　１５２７－１５４０．

　　　　志，２００７，　１５（６）：４９３－４９６．

＠＠［　８　］　　Ｚｈｏｕ　Ｃ，　　Ｐｅｔｒｏｌｌ　ＷＭ．　　Ｒｈｏ　ｋｉｎａｓｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　

２０１１－０５－１３

万方数据RhoA/Rho激酶信号通路在TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用

作者：作者单位：

胡永亮， 刘真， 焦大凯， 马恬， 王常勇， 贾赤宇， HU Yong-liang， LIU Zhen， JIAO Da-kai， MATian， WANG Chang-yong， JIA Chi-yu

胡永亮,刘真,马恬,贾赤宇,HU Yong-liang,LIU Zhen,MA Tian,JIA Chi-yu(第309医院整形美容烧伤修复中心, 北京,100091)， 焦大凯,JIAO Da-kai(航空工业中心医院整形外科)， 王常勇,WANG Chang-yong(军事医学科学院基础医学研究所组织工程研究室)中华整形外科杂志

Chinese Journal of Plastic Surgery2011,27(5)

刊名：英文刊名：年，卷(期)：

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