中国人兽共患病学报 ２０１２，２８（５） Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａ１ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ４１３ 文章编号：１００２—２６９４（２０１２）０５—０４１３—０５ 两株不同毒力ＥＶ７ １全基因组序列测定及分析＊ 李 鹏 ，宋楠楠 ，岳盈盈 ，李志会 ，张摘颖 ，盖中涛 ，孟 红 要：目的 了解济南市２００８年ＥＶ７１的流行和变异情况，寻求潜在的ＥＶ７１毒力决定位点。方法 采用分段扩增的 ＲＴ－ＰＣＲ方法对Ｅｖ７１ ＪＮ２００８０３和ＪＮ２００８０４株的基因组金长进行扩增、测序。对两株ＥＶ７１的全基因组核苷酸、氨基酸序 列进行比较，对非编码区进行ＲＮＡ二级结构的预测和分析，并对ＶＰ１区和全基因组进行遗传进化分析。结果 ＥＶ７１ ＪＮ２００８０３和ＪＮ２ＯＯ８Ｏ４株的基因组全长分别为７ ４０５ ｎｔ和７ ４０４ ｎｔ，编码区没有核苷酸的插入和缺失，全基因组序列的组成和 结构均符合肠道病毒７１型的特征。ＪＮ２００８０３和ＪＮ２００８０４全基因组有１０６个核苷酸突变，编码区９８个，非编码区８个，编码 区多数属于同义突变，仅造成１６个氨基酸突变。遗传进化分析显示，ＥＶ７１ ＪＮ２ＯＯ８Ｏ３和ＪＮ２ＯＯ８Ｏ４株与２００８年国内其他流 行株同属Ｃ４亚型的Ｃ４ａ进化分支，与Ｆｕｙａｎｇ／１７．０８／１株进化关系最近。结论２００８年济南市流行的ＥＶ７１属于Ｃ４ａ亚型， 济南分离株的毒力决定位点不但具有非单一性，而且具有较为独特的济南区域特点。 关键词：ＥＶ７１；毒力；全基因组；序列分析 中图分类号：Ｒ３７３．２文献标识码：Ａ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７ １ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅ ｒｅｎｔ ｌｅｖｅｅｌ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ＬＩ Ｐｅｎｇ ，ＳＯＮＧ Ｎａｎ～ｎａｎ ，ＹＵＥ Ｙｉｎｇ—ｙｉｎｇ ，ＬＩ Ｚｈｉ—ｈｕｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ。，ＧＡＩ Ｚｈｏｎｇ—ｔａｏ。，ＭＥＮＧ Ｈｏｎｇ （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｒａｒｅ ａｎｄ Ｕｎｃｏｍｍｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊｉｎａｎ ２５００６２，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｊｉｎａｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｎａｎ ２５００２１，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｉｎ ｏｒｄｏｒ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７ １（ＥＶ７ １）ｉｎ Ｊｉｎａｎ ｉｎ ２００８，ａｎｄ ｔｏ ｓｅｅｋ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ＥＶ７１，Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ＪＮ２ＯＯ８Ｏ３ ａｎｄ ＪＮ２００８０４ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ，ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ＥＶ７１ ＪＮ２０Ｏ８Ｏ３ ａｎｄ ＪＮ２ＯＯ８Ｏ４ ｇｅｎｏｍｅ ｗｅｒｅ ７ ４０５ ａｎｄ ７ ４０４ ｎｔ ｒｅ— ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｎｏ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＪＮ２００８０３ ａｎｄ ＪＮ２００８０４ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ １０６ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄｅｄ，ｉｎｄｕｄｉｎｇ ９８ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，８ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｈａｐｐｅｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｙｎｏｎｙ— ｍｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｅｘｃｅｐｔ １ ６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＶＰｌ ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＪＮ２００８０３ ａｎｄ ＪＮ２００８０４ ｈａｄ ｔｈｅ ｃｌｏｓｅｓｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ Ｆｕｙａｎｇ／１７．０８／１，ａｎｄ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｕｂｇｅｎｏ— ｔｙｐｅ Ｃ４ａ．Ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ＥＶ７ １ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｊｉｎａｎ ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｎｏｎ－ｓｉｎｇｕｌａｒｉｔｙ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｄｉｓ— ｔｒｉｃｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｊｉｎａｎ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１；ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ；ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ；ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ 肠道病毒７１型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１，ＥＶ７１）是引起 婴幼儿手足口病（Ｈａｎｄ Ｆｏｏｔ ａｎｄ Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ， 质炎样瘫痪等神经系统并发症，死亡率较高 ］。我 国２００８年安徽阜阳出现ＥＶ７１手足口病暴发，近几 ＨＦＭＤ）的主要病原之一，其感染可导致部分患者 无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、脊髓灰 ＊国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．８１０００７２０）和山东省自然科学基 金资助项目（ＺＲ２０１１ＨＱｏ３ｏ）联合资助 通讯作者：孟红，Ｅｍａｉｌ：ｍｅｎｇｈｌｃ＠１６３．ＣＯＩＦｓ 作者单位：１．山东省医学科学院基础医学研究所，山东省罕少见病 重点实验室，济南２５００６２； 年各地的手足口病疫情不断加剧［２］。目前重症 ＥＶ７１手足口病的嗜神经性致病机制仍不明确， ＥＶ７１毒力决定因子也未确定，给ＥＶ７１的防治带 来很大困难。为探讨序列变异对ＥＶ７１流行和毒力 变化的影响及目前济南流行株的遗传学背景，本研 究对济南市两株分别源自轻症和重症手足口病人的 ＥＶ７１分离株进行全基因组序列的测定和比较分 ２．济南市传染病医院，济南 ２５００２１ ４１４ 中国人兽共患病学报 １．２ 试剂 ＲＮＡ提取采用德国ＱＩＡＧＥＮ公司病 析，为ＥＶ７１致病机制和嗜神经性毒力位点的研究 提供参考。 １材料与方法 毒ＲＮＡ提取试剂盒（ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ），ｃＤＮＡ第一链合成试剂盒（ＱｕａｎｔＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ）、高保真ＤＮＡ聚合酶（Ｐｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ） 及凝胶ＤＮＡ回收试剂盒（ＴＩＡＮｇｅｌ Ｍｉｄｉ Ｐｕｒｉｆｉｃａ— ｔｉｏｎ Ｋｉｔ）均购白天根生化科技（ＪＬ京）有限公司。 １．３引物根据ＥＶ７１安徽阜阳株（ＥＵ７０３８１２）并 １．１ 毒株ＥＶ７１ ＪＮ２ＯＯ８Ｏ３株，分离自２００８年济 南市传染病医院仅患有皮疹的手足口病患者粪便标 本，接种１日龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠无明显临床症状； ＥＶ７１ ＪＮ２００８０４株，分离自２００８年济南市传染病 医院患有无菌性脑膜炎手足口病患者的粪便标本， 接种１日龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠可导致后肢麻痹，死亡。 参考ＢｒＣｒ株全基因组序列，利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０设计扩 增ＥＶＴ１全基因组核苷酸序列引物，９对引物首尾 相互重叠、覆盖全基因组，见表１。 表１ ＰＣＲ扩增用引物序列 Ｔａｂ．１ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ １．４ 病毒总ＲＮＡ的提取 把ＥＶ７１ ＪＮ２００８０３、 ＪＮ２００８０４株经ＭＡ１０４细胞扩增得到的细胞培养 物反复冻融３次，１２ ０００ ｇ离心５ ｒａｉｎ，取上清液 上的差异。 １．７非编码区的二级结构分析采用ＲＮＡｓｔｒｕｃ— ｔｕｒｅ５．３对ＥＶ７１ ＪＮ２００８０３和ＪＮ２００８０４株５ ＵＴＲ １４０“Ｌ按ＲＮＡ提取试剂盒的说明书进行操作。 １．５ ＲＴ—ＰＣＲ采用ｃＤＮＡ第一链合成试剂盒，将 病毒总ＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ，取逆转录反应产物 和３ ＵＴＲ的二级结构进行预测，并对其差异进行 分析。 １．８ 遗传进化分析 采用ＭＥＧＡ５．０５软件对 于２５肚Ｌ反应体系中进行ＰＣＲ反应。ＰＣＲ反应条 件：９４℃３ ｒａｉｎ；９４℃３０ Ｓ，Ｎ ３０ Ｓ，７２℃１ ｒａｉｎ，４０ Ｃｙｃｌｅｓ（Ｎ为退火温度，各引物不同）；７２℃１０ ｒａｉｎ。 Ｅｖ７１ ＪＮ２ＯＯ８Ｏ３和ＪＮ２ＯＯ８Ｏ４株进行遗传进化分 析，将其与国内外各型ＥＶ７１毒株的发育关系进行 研究。 ＰＣＲ扩增的特异性片段经１ 琼脂糖凝胶电泳分 离，回收后送公司测序、拼接。 １．６ 全基因组序列的比对采用ｃｌｕｓｔａｌｘ１．８３对 ＥＶ７１ ＪＮ２００８０３和ＪＮ２００８０４的核苷酸和氨基酸序 列进行比对，找出两株病毒在核苷酸和氨基酸序列 ２ 结 果 ２．１ 全基因组序列测定分析 不包含多聚腺苷酸 尾ＥＶ７１ ＪＮ２００８Ｏ３株全基因组长度为７ ４０５ｎｔ， ＥＶ７１ ＪＮ２ＯＯ８Ｏ４株全基因组长度为７ ４０４ｎｔ。 ５期 李 鹏等：两株不同毒力ＥＶ７１全基因组序列测定及分析４１５ ＪＮ２００８０３株５ 端非编码区（５ ＵＴＲ）为７４２ｎｔ， 酸的改变；１６个突变氨基酸的分布为，ＶＰ３ ３个， ＪＮ２Ｏ０８０４株为７４１ｎｔ；两毒株基因组编码区均为 ＶＰＩ １个，２Ａ １个，２Ｂ ３个，２Ｃ ４个，３Ｃ ２个，３Ｄ ２ ６５８２ｎｔ，编码２１９３个氨基酸的多聚蛋白（Ｐｏｌｙｐｒｏ— 个，而ＶＰ４、ＶＰ２、３Ａ和３Ｂ氨基酸没有发生突变， ｔｅｉｎ）；３ 端非编码区（３ ＵＴＲ）均为８１ｎｔ。ＪＮ２００８０３ 表３。 和ＪＮ２０Ｏ８Ｏ４株病毒基因组的组成和结构均符合 表２两株ＥＶ７１非编码区序列比较结果 ＥＶ７１的特征。测定的全基因组序列已上传至 Ｔａｂ．２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ＪＮ２００８０３ ＧＥＮＥＢＡＮＫ，ＥＶ７１ ＪＮ２００８０３和ＪＮ２００８０４株的序 ａｎｄ ＪＮ２００８０４ 列登记号分别为：ＪＦ９１３４６４和ＨＱ８２５３１７。 Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ２．２ 两株ＥＶ７１核苷酸和氨基酸序列差异分析 Ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＪＮ２００８０３－，，－ＪＮ２００８０４） ＥＶ７１ ＪＮ２００８０３和ＪＮ２００８０４株非编码区核苷酸序 列比较发现，５ ＵＴＲ共有７个核苷酸的差异，除９９ 位ＪＮ２ＯＯ８Ｏ４株缺失１个胞嘧啶核苷酸（ｃ）外，其余 ６个均为核苷酸的转换；３ ＵＴＲ只有７３４７位１个核 苷酸的发生转换，见表２。ＥＶ７１ ＪＮ２ＯＯ８Ｏ３和 ＪＮ２００８０４株编码区核苷酸及氨基酸序列比较发现， 二者在编码区没有核苷酸的缺失和插入，共有９８个 核苷酸的差异，且突变类型全都属于转换，但大部分 核苷酸的突变属于同义突变，仅有１６个造成了氨基 表３两株ＥＶ７１编码区序列比较结果 Ｔａｂ．３ Ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ＪＮ２００８０３ ａｎｄ ＪＮ２００８０４ ２．３ 两株ＥＶ７１非编码区二级结构差异分析 （ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ，ＩＲＥＳ）第Ⅵ结构域相 ＥＶ７１ ５ ＵＴＲ第４５３～５６１位碱基（ＢｒＣｒ株碱基位 对应，该区被认为同脊髓灰质炎病毒（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）的 置）区与脊髓灰质炎病毒的内部核糖体进入位点 毒力密切相关 。然而Ｅｖ７１ ＪＮ２ＯＯ８Ｏ３和ＪＮ２００８０４ ４１６ 中国人兽共患病学报 株在此区核苷酸序列完全相同，表明造成二者毒力 差别的毒力决定位点可能并不在５ ＵＴＲ。采用 ＲＮＡＳｔｒｕｃｔｕｒｅ５．３对３ ＵＴＲ进行了ＲＮＡ二级结 构预测。从图１可以看到ＥＶ７１ ＪＮ２００８０３和 ＪＮ２００８０４株二级结构仅３ ＵＴＲ第２３位（基因组 ７３４７位）与第５２位（基因组７３７６位）碱基配对有差 异，ＪＮ２ＯＯ８Ｏ３的Ｇ—Ｔ不能形成稳定的配对，而 ＪＮ２００８０４的Ａ—Ｔ的配对很稳定。ＪＮ２００８０４株形 成二级结构所需自由能低于ＪＮ２ＯＯ８Ｏ３株，毒力较 强的ＪＮ２００８０４株的二级结构更稳定。 Ｊ№ＤＤ ｊＨ ＊ 图１ ＪＮ２００８０３和ＪＮ２００８０４株３ ＵＴＲ二级结构预测 Ｆｉｇ．１ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ＥＶ７１ ３ ＵＴＲ ｏｆ ＪＮ２００８０３ ａｎｄ ＪＮ２００８０４ Ｎｏｔｅ：△Ｇ ｏｆ ＪＮ２００８０３ ａｎｄ ＪＮ２００８０４ ｗｅｒｅ一２５．４ ｋｃａｌ／ｍｏｌ ａｎｄ．２５．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ２．４两株ＥＶ７１的遗传进化分析 采用ＭＥＧＡ５． ０５软件，通过邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ—ｊｏｉｎｉｎｇ），以柯萨奇 病毒Ａ１６型（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ Ａ１６，ｃＶＡ１６）为外群， 对ＥＶ７１ ＪＮ２００８０３、ＪＮ２００８０４及ＧｅｎＢａｎｋ中各亚 卜ｐ卜卜ｐ 卜卜卜 型ＥＶ７１的ＶＰ１及全基因组核苷酸序列进行遗传 进化分析（图２，图３）。可见ＪＮ２００８０３和ＪＮ２００８０４ 株与Ｆｕｙａｎｇ／１７．０８／１株进化关系最近，同属于Ｃ４ 基因亚型的Ｃ４ａ进化分支。２００８年国内主要的 ＥＶ７１流行株进化关系非常密切，与国外ＥＶ７１毒 株进化关系较远。 ３讨 论 ＥＶ７１进化过程中的基因突变是造成毒力改变 的主要因素之一。ＭｃＭｉｎｎ等 发现ＥＶ７１澳大利 亚流行株中只表现ＨＦＭＤ与具有神经毒性分离株 的主要区别在于ＶＰ１第１７０氨基酸从丙氨酸（Ａｌａ） 突变为缬氨酸（Ｖａ１）。Ｆｕｊｉｍｏｔｏ等 发现日本 Ｈｙｏｇｏ地区表现为脑干脑炎ＥＶ ７，１毒株的ＶＰ４基 因序列均一致，与表现为手足口病ＥＶ７１毒株有较 大差异。Ｓｈｉｈ等＿６ 比较了致死和非致死病例感染 图２ ＥＶ７１ ＶＰ１区的遗传进化分析 Ｆｉｇ．２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ＶＰＩ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ＥＶ７１ 图３ ＥＶ７１全基因组核苷酸序列的遗传进化分析 Ｆｉｇ．３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅ。 ｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＥＶ７１ 的ＥＶ７１的基因组全序列，发现非结构蛋白３Ｃ区域 的核苷酸序列存在较大差异。Ｃｈａｎｇ等ｌ＿７ 对中国６ 株不同毒力ＥＶ７１分离株全基因组序列分析发现，３ 株临床轻症分离株与３株临床重症分离株唯一相同 的差别是第１９９４位氨基酸（３Ｄ区）由缬氨酸（Ｖａ１） 突变为异亮氨酸（１ｉｅ）。Ｗａｎｇ等［８ 将实验鼠感染不 致病ＥＶ７１毒株４６４３与具有神经嗜性突变毒株 ＭＰ４进行全基因组序列分析，结果ＭＰ４ ５ ＵＴＲ区 有４个核苷酸突变。 本文两株不同毒力ＥＶ７１的全基因组序列比较 发现，编码区有１６个氨基酸发生了突变，其中ＶＰ３ ３个，ＶＰ１ １个，２Ａ １个，２Ｂ ３个，２Ｃ ４个，３Ｃ ２个， ３Ｄ ２个，而ＶＰ４、ＶＰ２、３Ａ和３Ｂ氨基酸未发生突 变。其中３Ｄ区的突变与中国其他省ＥＶ７１轻重株 （重株：安徽１株、河南２株，轻株：重庆３株）氨基酸 ５期 李 鹏等：两株不同毒力ＥＶ７１全基因组序列测定及分析４１７ 突变不同［７］，ＪＮ２ＯＯ８Ｏ３和ＪＮ２００８０４株第１９９４位氨 基酸均为异亮氨酸（Ｉｌｅ），与重庆的３株轻株相同。 ＶＰ３、２Ａ、２Ｂ和２Ｃ区虽然在已有报道中不是常见 的毒力决定区域，但也可能存在对病毒毒力有影响 的位点，Ｗｈｉｔｔｏｎ等 发现脊髓灰质炎病毒ＶＰ３第 ９１位氨基酸对病毒致病性具有重要意义。因而 Ｅｖ７１毒力决定位点不但具有非单一性，而且具有 明显的区域独特性，与当地的流行特点密切相关。 小ＲＮＡ病毒科（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）病毒的５ ＵＴＲ有一个与翻译密切相关的ＩＲＥＳ，ＥＶ７１与脊 髓灰质炎病毒的ＩＲＥＳ为同一类型，结构与功能极 为相似 ］。脊髓灰质炎病毒ＩＲＥＳ的第Ⅵ结构域被 认为与其毒力密切相关，而ＪＮ２００８０３和ＪＮ２００８０４ 株在此区域核苷酸序列完全相同，可见ＥＶ７１济南 分离株的毒力决定位点可能不在５ ＵＴＲ。ＥＶ７１ ３ ＵＴＲ被认为与病毒负链合成相关，对病毒基因 组的转录和复制有重要的作用，而ＥＶ７１ ＪＮ２００８０３和ＪＮ２００８０４株３ ＵＴＲ只有一个核苷酸 的不同，分析发现ＪＮ２００８０４株的二级结构更稳定， 对病毒基因组的转录和复制更为有利。 通常认为ＶＰ１区全长核苷酸序列分析可作为 肠道病毒属血清型分类的依据＿１ 。本文将ＥＶＴ１ 济南分离株与２００８年国内主要流行株及其他亚型 ＥＶ７１进行了ＶＰ１和全基因组遗传进化分析，发现 两株ＥＶ７１济南分离株同属Ｃ４亚型的Ｃ４ａ进化分 支，与Ｆｕｙａｎｇ／１７．０８／１株进化关系最近，应具有共 同的起源。另外，中国１９９８年以来的ＥＶ７１毒 株均为Ｃ４亚型，２００８年的分离株均为Ｃ４亚型的 Ｃ４ａ进化分支；与国外病毒株相比，中国ＥＶ７１ 分离株与中国分离株的亲缘关系更近。总之， 对相同疫源中不同毒力ＥＶ７１分离株（ＥＶ７１ ＪＮ２００８０３和ＪＮ２００８０４株）的全基因组序列进行比 较，发现潜在的毒力决定位点，分析ＥＶ７１的变异情 况和流行特点，对ＥＶ７１手足口病的防治具有重要 意义。 参考文献： ［１］Ｓｃｈｕｆｆｅｎｅｃｋｅｒ Ｉ，Ｍｉｒａｎｄ Ａ，Ａｎｔｏｎａ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｒａｎｃｅ，２０００—２００９［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ，２０１１，５０（１）：５０－５６． ［２］陈炜，周朝晖，沈晓娜，等．福建省肠道病毒７１型分离株 （２０１０ＦＪＬＹ０ｏ８）全基因组核苷酸序列分析［Ｊ］．中国人兽共患病 学报．２０１１，２７（１）：１４—１８． ［３］Ｋｌｉｎｃｋ Ｒ，Ｓｐｒｕｌｅｓ Ｔ，Ｇｅｈｒｉｎｇ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ— ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ＲＮＡ ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｏｏｐｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏ— ｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ ｏｆ ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓｅｓ［－Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９７，２５ （１１）：２１２９—２１３７． ［４］ＭｃＭｉｎｎ Ｐ，Ｌｉｎｄｓａｙ Ｋ，Ｐｅｒｅｒａ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｌｉｎｋｅｄ ｅｐｉｄｅｍｉｃｓ ｉｎ Ｍａｌａｙ— ｓｉａ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００１，７５ （１６）：７７３２－７７３８． ［５］Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｔ，Ｃｈｉｋａｈｉｒａ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｄｉｓｅａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ，ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｊａｐａｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｍｍｅｒ ｏｆ ２０００：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏ— ｌｅｅｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１ Ｉ－Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００２，４６（９）：６２１—６２７． ［６￣Ｓｈｉｈ ＳＲ，Ｈｏ ＭＳ，Ｌｉｎ ＫＨ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｔａｌ ａｎｄ ｎｏｎ－ｆａｔａｌ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｕｒｉｎｇ ａｎｅｐｉｄｅｍｉｃ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ，１９９８［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ，２０００，６８：１２７－１３６． ［７］Ｃｈａｎｇ ＧＨ，Ｌｉｎ Ｌ，Ｌｕｏ ＹＪ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｘ ｅｎ— ｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ｛－Ｊ］．Ｖｉ— ｒｕｓ Ｒｅｓ，２０１０，１５１（１）：６６－７３． ［８］Ｗａｎｇ ＹＦ，Ｃｈｏｕ ＣＴ，Ｌｅｉ ＨＹ，ｅｔ ａ１．Ａ Ｍｏｕｓｅ—Ａｄａｐｔｅｄ Ｅｎｔｅｒｏ— ｖｉｒｕｓ ７１ Ｓｔｒａｉｎ Ｃａｕｓｅｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ Ｏｒａｌ Ｉｎ— ｆｅｃｔｉｏｎ［－Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４，７８：７９１６－７９２４． ［９］Ｗｈｉｔｔｏｎ ＪＬ，Ｃｏｒｎｅｌｌ ＣＴ，Ｆｅｕｅｒ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｈｏｓｔ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｒ— ｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｏｐｉｓｍ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，３（１Ｏ）：７６５－７７６． ［１Ｏ］Ｔｓａｉ ＦＪ，Ｌｉｎ ＣＷ，Ｌａｉ ＣＣ，ｅｔ ａ１．Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒ— ｕｓ ７１ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）ａｃｔｉｖｉ— ｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ＦＵＢＰ ａｎｄ ＨＮＲＰ ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２Ｏ１１，１２８（２）：３１２ ３２２． ［１１］Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｔａｎ ＸＪ，Ｗａｎｇ ＨＹ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｈａｎｄ， ｆｏｏｔ，ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｂｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ４ ｏｆ ｈｕ— ｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１ ｉｎ Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ，２００９， ４４（４）：２６２－２６７． 收稿日期：２０１１－１２—２０；修回日期：２０１２—０２—２５
