第３２卷第２期 ２０１０年２月 中国预防兽医学报 ＶＯ１．３２．Ｎｏ．２ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｅｂ． ２０ｌ０ 牛瑟氏泰勒虫环介导等 温扩 增检测方法的建立 王中光，张守发 ，曹世诺，贾立军，薛书江，田万年，王暖成 （延边大学农学院动物医学系，吉林龙井１３３４００） 摘 要：为建立快捷、灵敏的牛瑟氏泰勒虫（Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔＯ检测方法，本研究以感染牛丁．ｓｅｒｇｅｎｔｉ的阳性血液为 试验材料，建立了牛Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ Ｐ３３表面蛋白基因环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）检测技术，并优化了ＬＡＭＰ的各反应条 件，进行了敏感性和特异性试验。结果显示，扩增产物经显色、电泳、酶切鉴定后，ＬＡＭＰ方法扩增牛１１． ｓｅｒｇｅｎｔｉ产物检测管显色后呈阳性反应，最低检测量为２．３ Ｌ模板ＤＮＡ，比普通ＰＣＲ高１０倍，牛Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ ＬＡＭＰ产物电泳后呈特征性梯状条带，而弓形虫等对照组均无扩增条带。说明本研究建立的ＬＡＭＰ方法具有灵 敏、特异、快速等优点，适合于牛Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ的检测。 关键词：牛瑟氏泰勒虫；Ｐ３３表面蛋白基因；环介导等温扩增技术 中图分类号：￥８５２．７２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８．０５８９（２０１０）０２—０１０８—０４ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＬＡＭＰ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｓｅｒｇｅｎｔｉ ＷＡＮＧ Ｚｈｏｎｇ—ｇｕａｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｓｈｏｕ—ｆａ ，ＣＡＯ Ｓｈｉ—ＩｌＵＯ，ＪＩＡ Ｌｉ－ｊｕｎ， ＸＵＥ Ｓｈｕ－ｊｉａｎｇ，ＴＩＡＮ Ｗａｎ－ｎｉａｎ，ＷＡＮＧ Ｎｕａｎ—ｃｈｅｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｙａｎｂｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｏｎ ｉｎｇ １ ３３４００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｓｅｒｇｅｎｔｉ，ａ ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＬＡＭＰ）ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｏｒｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ Ｐ３３ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ．ＬＡＭＰ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｕｎｄｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｂｙ ｎａｋｅｄ ｅｙｅ，ｅｌｅｃｔｘｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ２．３ ｆｇ／ＩｘＬ ＤＮＡ ｉｓ ｆａｓｔ．ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｓｅｒｇｅｎｔｉ；ｐ３３ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ；ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ＬＡＭＰ 牛瑟氏泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰 勒虫（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｓｅｒｇｅｎｔｉ）寄生于牛红细胞和淋巴细胞 但这些技术均需要昂贵的仪器设备，了这些检 测方法的推广和应用。本研究采用了Ｎｏｔｏｍｉ等人发 明的环介导等温核酸扩增技术（Ｌｏｏｐ．ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）建立了一种检测牛 引起的以高热、贫血、出血、消瘦和体表淋巴结肿 大为主要临床症状的一种血液原虫病。该病呈世界 性分布，我国东北、西北、华北、华南等地区牛丁． Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ病的方法，以期为牛Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ病的快速 诊断奠定基础【２］。 ｓｅｒｇｅｎｔｉ感染情况较严重。近年来，牛Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ病 的发生呈上升趋势，给畜牧业带来了巨大的经济损 失，引起了国内外兽医界的广泛关注。目前，已报 １ 材料和方法 １．１ 虫株及血样来源Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ血样取自延边某 道的牛Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ分子生物学诊断方法主要有生物 素标记的ＤＮＡ探针检测技术和ＰＣＲ检测技术ｌｌ】等。 ＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ 收稿日期：２００９—０５—１４ 基金项目：国家自然科学基金（３０５６０１ １２） 作者简介：王中光（１９８３一），女，吉林松原人，硕士研究生，从事分子免疫学研究 通信作者：Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｈｏｕｆａｚｈａｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ 第２期 王中光，等．牛瑟氏泰勒虫环介导等温扩增检测方法的建立 终浓度在８ ｍＭ和１０ ｍＭ之问、扩增温度在６３℃和 ６５℃、以及反应时间为４５ ｍｉｎ和６０ ａｒｉｎ时达到了最 佳的扩增效果。扩增产物经性内切酶Ｓｅａ Ｉ｝肖化 后应成为２条主带（１ １４ ｂｐ和１２９ ｂｐ），但由于这两条 带大小接近，因此很难分开，所以图中显示为一条 很宽的带，与预期结果完全相符，证明了该方法有 较高的特异性。敏感性试验表明该法较普通ＰＣＲ的 敏感陛更高，模板ＤＮＡ最低检测量为２．３ ｆｇ／ 。 Ｐ３３表面蛋白基因为Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｆｉ序列中的高度保 守序列，是诊断和预防牛Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ病理想的基因。 国内外对牛Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ Ｐ３３表面蛋白的研究较多 ］， 但未见有关ＬＡＭＰ检测Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ方法的报道。 ＬＡＭＰ法通过独特的引物反转设计，利用了具 有链置换特性的Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶在６０℃～６５℃具 有解旋功能和瀑布式扩增功能，在等温的情况下即 可实现核酸的变性和扩增＿５＿，几十分钟即可完成，不 需要模板的变性、退火、长时问温度循环等过程； 特异性高，本实验建立的ＬＡＭＰ法是针对Ｐ３３基因 的６个不同的区域设计的４条引物，任何一个不匹 配反应就会无法进行，最大限度降低了非特异性的 产生，特异性试验和酶切试验结果也进一步表明该 方法具有极高的特异性；该检测方法成本低廉，只 需要一个恒温水浴锅就能进行，也不需要其他昂贵 的耗材，因此可作为检测Ｔ．ｓｅｒｇｅｎｔｉ感染的新方法推 广使用。此外，本研究在扩增产物中直接加入ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ染料，反应液颜色变为绿色且在紫外灯下发 出绿色荧光，阴性则保持染料原色不变［６－９］，特别适 合在基层部门使用。 当前，ＬＡＭＰ用于病毒、细菌、真菌的快速灵 敏特异检测和其他方面的检测已经成为热点，本实 验应用ＬＡＭＰ方法对延边某牧场的９份牛血液样本 进行检测，结果牛 ｓｅｒｇｅｎｔｉ的阳性检出率为１００％， 表明ＬＡＭＰ方法扩增Ｐ３３基因具有特异性强、操作 简便、快速、成本低等优点，具有很高的实用价 值。 参考文献： ［１］ 金春梅，许应天，张守发，等．牛瑟氏泰勒虫病ＰＣＲ诊断 方法的建立［Ｊ１ｌ畜牧与兽医，２００７，３９（５）：４６—４８． 【２】 Ｎｏｔｏｍｉ Ｔ，Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０００， ２８：Ｅ６３． ［３］ 曹世诺，于龙政，张守发，等．牛瑟氏泰勒虫Ｐ２３和Ｐ３３表 面蛋白双基因融合表达载体的构建及原核表达［Ｊ］．中国预 防兽医学报，２００８，３０（１１）：８６６—８６９． ［４］ 曹世诺，于龙政，张守发，等．奶牛瑟氏泰勒虫Ｐ３３表面蛋 白基因的克隆及序列分析［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２００８，３： １５—１７． ［５］ 秦智峰，曾少灵，阮周曦，等．口蹄疫病毒ＲＴ．ＬＡＭＰ检测 方法的建立［Ｊ Ｊｌ中国预防兽医学报，２００８，３０（５）：３７５—３７８． ［６】Ｄｕｋｅｓ Ｊ Ｐ，Ｋｉｎｇ Ｄ Ｐ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒｓｅｎ Ｓ．Ｎｏｖｅｌ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ ｔｉｏｎ ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｏｔ—ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ，２００６，１５１： １０９３—１１０６． ［７］ Ｍｏｒｉ Ｙ，Ｎａｇａｍｉｎｅ Ｋ，Ｔｏｍｉｔａ Ｎ，ｅｔ ａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉ— ａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｍａｇｎｅ－ｓｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００１，２８９：１５０—１５４． ［８］ １ｗａｓａｋｉ Ｍ Ｙ，Ｙｏｎｅｋａｗａ Ｔ，Ｏｔｓｕｋａ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｏｐ－・ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕ－・ ｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ［Ｊ］ｌＧｅｎｏｍｅ Ｌｅｔｔ，２００３，２：１ １９－１２６． ［９］Ｐｏｏｈ Ｌ Ｌ Ｍ，Ｌｅｕｎｇ Ｃ Ｓ Ｗ，Ｃｈａｎ Ｋ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｈｕ— ｍａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｕｒｓｅｓ ｂｙ ｌｏｏｐ・－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｉｆｃａ－－ ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，４３：４２７－４３０． （本文编辑：彭永刚）
