[19]中华人民共和国专利局
[12]发明专利申请公开说明书
[21]申请号97120412.8
[51]Int.CI6
C07K 2/00C07K 5/00C07K 7/00C07K 14/00
[43]公开日1998年4月15日[22]申请日97.9.30
[30]优先权
[32]96.10.02 [33]EP [31]96115784.9[71]申请人弗·哈夫曼－拉罗切有限公司
地址瑞士巴塞尔
[72]发明人J·Y·莱根德里 A·苏普萨科索 A·特
泽希亚克
[11]公开号CN 1178797A
[74]专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标
事务所
代理人陈文平
A61K 48/00C12N 5/10
权利要求书 2 页 说明书 8 页
[54]发明名称
包含α,γ－二氨基丁酸的寡肽衍生物
[57]摘要
含有α,γ－二氨基丁酸(DAB)的下式的寡肽衍生物,其在用多核苷酸或任何其它阴离子大分子转染细胞中作为载体有用:R′－NH－A,其中R′是细胞识别剂、膜通透剂、亚细胞定位剂或掩蔽剂;A是缺少一个氨基并包含1到200个氨基酸的寡肽,其中至少一个氨基酸是α,γ－二氨基丁酸(DAB),且寡肽的末端羧基转变成酰胺、低级烷基酰胺、二低级烷基酰胺或酰肼。
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权 利 要 求 书
第1/2页
1.含有α，β-二氨基丁酸(DAB)的下式的寡肽衍生物； R′-NH-A
其中R′是细胞识别剂、膜通透剂、亚细胞定位剂或掩蔽剂； A是缺少一个氨基并包含1到200个氨基酸的寡肽，其中至少一个氨基酸是α，γ-二氨基丁酸(DAB)，且寡肽的末端羧基转变成酰胺、低级烷基酰胺、二低级烷基酰胺或酰肼。
2.按照权利要求1的化合物，其中所说的细胞识别剂是靶向细胞表面受体的抗体或抗体片段、激素、蛋白质生长因子、细胞因子和/或配体。 3.按照权利要求1或2的化合物，其中所说的亚细胞定位剂是能够将多核苷酸或阴离子大分子从细胞质运送到细胞核的核定位分子。 4.按照权利要求1到3中任一项的化合物，其中所说的膜通透剂是帮助多核苷酸或阴离子大分子通过膜的分子。
5.按照权利要求1到4中任一项的化合物，其中所说的掩蔽剂是能够增加多核苷酸或阴离子大分子的循环半衰期的分子。
6.按照权利要求1到5中任一项的化合物，其中所说的寡肽的末端羧基转变成酰肼。
7.按照权利要求1到6的至少一种式I化合物在用多核苷酸或任何其它阴离子大分子转染细胞中作为载体的用途。
8.按照权利要求7的用途，其在阳离子脂质或任何其它转染活性分子存在下使用。
9.按照权利要求7和8中任一项的用途，其在辅助脂质存在下使用。 10.按照权利要求7到9中任一项的用途，其在短链磷脂存在下使用。
11.一种包含至少一种按照权利要求1到6中任一项的式I化合物和可有可无的辅助脂类、短链磷脂和/或另一转染活性分子的组合物。 12.按照权利要求11的组合物，其中所说的组分是水溶液或有机溶液、水分散液或有机分散液、或者脂质体或微胶粒形式。 13.按照权利要求11或12的组合物，其中所说的组合物是固体、液
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体、半固体或气溶胶形式。
14.按照权利要求11到13中任一项的组合物，其中包含多核苷酸或任何其它阴离子大分子。
15.本文所描述的新化合物、组合物的用途，特别是参见实施例的那些。
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说 明 书
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包含α，γ-二氨基丁酸的寡肽衍生物
基因转移技术已经成为相当令人感兴趣的领域。将外源基因引入到细胞中(即转染)具有许多重要的科学和医疗应用，该应用涉及从基因调节和重组蛋白质产生到基因治疗。
病毒已能够绕过不同细胞障碍进行基因转移，并且已实际成为所选择的转染载体。包括逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒的许多病毒目前被工程化来携带治疗基因和用于基因治疗的人类临床试验。然而存在着出现感染和免疫反应的危险，而且大量产生病毒是困难的和耗时的。 由于这些不同的原因，已开发非病毒系统将DNA携带至细胞中，例如基于阳离子脂质，以Lipofectin
TM
投放市场的二油酰基氧丙基三甲基
铵(Felgner等，美国科学院学报，84，7413-7417，1987)的转染技术。因为发现了这一转染技术，所以合成了许多阳离子脂质，某些作为供实验室使用的转染剂可从市场上购得：DOGS(Transfectanm)、DOSPA(Lipofectamine)、DOTAP(DOTAP)。
然而，尽管在非病毒基因传递系统配方上有重要的进步，但仍需要更有效的技术，因为合成系统的转染效率通常低于病毒载体的效率。而且，体内出现的许多问题和在生物体液中非病毒系统的差的稳定性仍然使得不能以高的和可再现的水平进行体内转染。
按照本发明，已经发现包含α，γ-二氨基丁酸(DAB)的寡肽衍生物结合多核苷酸和阴离子大分子，并且可以用于转染细胞。 由此，在一个方面，本发明涉及新的含有α，γ-二氨基丁酸(DAB)的下式的寡肽衍生物 R′-NH-A I
其中R′是细胞识别剂、膜通透剂、亚细胞定位剂或掩蔽剂； A是缺少一个氨基并包含1到200个氨基酸的寡肽，其中至少一个
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TM
TM
TM
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氨基酸是α，γ-二氨基丁酸(DAB)，且寡肽的末端羧基转变成酰胺，低级烷基酰胺、二低级烷基酰胺或酰肼。
所述的寡肽A可以是直链的或支链的。氨基酸可以属于L-或D-系列或者可以是外消旋的。其中A是缺少一个氨基并包含1到50个氨基酸的寡肽的式I化合物是优选的。更优选的是其中寡肽A包含1到20个氨基酸的式I化合物。
另一个优选的实施方案是其中寡肽A的末端羧基转变成酰肼的式I化合物。
本文使用的“细胞识别剂”指能够识别靶细胞表面组分的分子。细胞识别组分包括针对细胞表面抗原的抗体、包括受体介导胞吞作用相关的那些在内的细胞表面受体的配体、肽激素等。本发明所涉及的特定配体包括糖配体，例如半乳糖、甘露糖、甘露糖基-5-磷酸、墨角藻糖、唾液酸类、N-乙酰氨基葡糖胺或作为复合糖类的这些基团的组合，如在血型糖脂上或在各种分泌蛋白质上发现的那些。其它配体包括叶酸盐、生物素、可以与细胞表面或胞内受体相互作用的各种肽类，如化学引诱物肽N-甲酰基-met-leu-phe(SEQ ID NO：2，WO-A-O 2397)、包含arg-asp-gly序列的肽类或cys-ser-gly-arg-glu-asp-val-trp(SEQ IDNo：3同上)肽类、包含胱氨酸残基的肽类或与细胞表面蛋白质(如人类免疫缺陷病毒GP-120)相互作用的肽类、和与CD-4相互作用的肽。其它配体包括抗体或抗体片段，例如由Hertler和Frankel(Hertler，A.和Frankel，A.，临床癌学杂志.7：1932(19))所描述的那些。抗体的特异性可以直接针对能够在细胞表面表达的表位，包括组织相容性大分子、自身免疫抗原、病毒、寄生虫或细菌蛋白质。其它蛋白质配体包括激素，例如生长激素和胰岛素或蛋白质生长因子，如GM-CSF、G-CSF、促红细胞生成素、表皮生长因子、碱性和酸性成纤维细胞生长因子等。其它蛋白质配体包括通过细胞表面受体起作用的各种细胞因子，如白介素2、白介素1、白介素12、肿瘤坏死因子、以及来源于这些大分子的适合的肽片段。
在另一实施方案中，所说的细胞识别分子是整联蛋白-结合肽或其衍生物。在一个更优选的实施方案中，所述整联蛋白-结合肽是
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GGCRGDMFGCGG。
本文使用的“膜通透剂”指帮助多核苷酸或阴离子大分子通过膜的分子。膜通透剂的例子是蜂毒肽、溶血素、肥大脱粒肽、bombolitin、crabrolin、pardaxin、短杆菌肽、丙甲菌素、apidaecin、bactenecin、杀菌肽、防卫素、dermaseptin、indolicidin、爪蟾抗菌肽、铃蟾抗菌肽、brevinin、esculentin、seminalplasmin和其衍生物(G.Saberwal和R.Nagaraj.BBA 1197：109-131(1994))。其它膜通透剂是在《生物化学杂志》Vol.269(17)，12918-12924(1984)中描述的含有流感病毒血细胞凝集素的氨基末端氨基酸序列的肽和其合成的衍生物(表I)；或在《生物化学和生物物理学报》1240，95-100(1995)中描述的HIV和SIV融合肽和其合成的衍生物(图1)。另一类细胞通透剂是去垢剂分子，如胆汁酸盐。去垢剂分子的其它例子是蔗糖单月桂酸正辛基葡糖苷和生育酚基PEG 1000琥珀酸。然而其它去垢剂分子也是合适的。
在另一个实施方案中，所述的膜通透剂是膜通透剂和脂类之间的连接物。这种连接物的一个例子是具有NH2末端豆蔻酸的phe-glu-ala-ala-leu-ala-glu-ala-leu-ala-glu-ala-leu-ala(C.Puyal等，BBA 1195：259-266(1994))。
本文使用的“亚细胞定位剂”指在靶细胞中能识别亚细胞组分的分子。特定的亚细胞组分包括核、核糖体、线粒体和叶绿体。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述的亚细胞定位组分是核定位组分。该核定位组分包括确定了氨基酸序列的已知肽，和含有这些肽的较长序列。一种已知的肽序列是SV40大T抗原七肽pro-lys-lys-lys-arg-lys-val(SEQ ID No：1，Wo-A-0 2397)。其它肽包括流感病毒核蛋白+肽ala-ala-phe-glu-asp-leu-arg-val-leu-ser(SEQ ID No：4，同上)，和腺病毒Ela蛋白质片段lys-arg-pro-arg-pro(SEQ ID No：5，同上)。其它的序列可以从Dingwall等(Dingwall，C.等，TIBS 16：478(1991)中了解。 在另一实施方案中，所述亚细胞定位组分是溶酶体定位组分。靶向溶酶体的一个已知组分是含有lys-phe-glu-arg-gln(SEQ ID No：6 WO-A-0 2397)片段的肽。
在另一个实施方案中，亚细胞定位组分是线粒体定位组分，靶向线
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粒体的一个已知组分是含有序列met-leu-ser-leu-arg-gln-ser-ile-arg-phe-phe-lys-pro-ala-thr-arg(SEQ ID No：7，同上)的肽。然而，其它亚细胞定位组分和试剂也是合适的。
本文使用的“掩蔽剂”指能够掩蔽全部或部分多核苷酸或阴离子大分子的分子，这种掩蔽通过抑制存在于循环中的降解剂的攻击或通过阻断被网状内皮系统的摄取而增加所述多核苷酸或阴离子大分子的循环半衰期。这种掩蔽剂的一个例子是聚乙二醇(PEG)。该PEG可以具有约700到20,000道尔顿，优选约1800到6000道尔顿的分子量。 可以用本领域公知的方法制备式I的化合物。例如，用类似于《基因治疗》(1995)2，552-554中所描述的方法。因此本发明涉及制备式I的新化合物的方法。
本发明还涉及式I的化合物作为载体在将多核苷酸或任何其它阴离子大分子转移到细胞中的用途。
可以通过本发明的新化合物转移到细胞中的多核苷酸的例子是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。非多核苷酸的阴离子大分子的例子是蛋白质，例如核糖核蛋白和用于免疫的蛋白质，如病毒蛋白质。 可以通过本发明的新化合物转移进细胞的DNA的例子是质粒或基因，尤其是已进行基因治疗方案研究的那些，例如囊性纤维变性跨膜调节物(CFTR)、腺苷脱氨酶(ADA)，胸苷激酶(tk)和HLAB7；以
及报道基因，例如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶和α-1抗胰蛋白酶。DNA的其它例子是用作反义、aptamer或“三螺旋”剂的寡脱氧核苷酸和它们的类似物。RNA的例子是核酶或寡核糖核苷酸反义分子。
待转染的细胞的性质不是至关紧要的。所述细胞可以是原核或真核细胞、哺乳动物或植物细胞。
使用本发明化合物的转染过程可以按照本身已知的方法进行。用例如DNA或RNA转染细胞时，带正电荷的式I的化合物和带负电荷的DNA或RNA之间+/-电荷比例在0.1到50的范围内，更优选的是从0.1到10。 转染可以在辅助脂类、短链磷脂和/或其它已知的转染活性分子存在下进行。辅助脂类的例子是磷脂，例如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺或它
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们的混合物。优选的辅助脂类是磷脂酰乙醇胺，例如二油酰基磷脂酰乙醇胺。短链磷酯的例子是携带有两个C6-C12脂肪酸残基的磷脂酰胆碱。优选的短链磷脂是二辛基-或二辛酰基磷脂酰胆碱。所述辅助脂类和/或短链磷脂适于以脂质体、混合的微胶粒、有机溶液或水分散液形式存在。 转染活性分子的例子包括如J.B.Behr在《生物连接物化学》5：382-3(1994)和X.Gao和L，Huang在《基因治疗》2：710-722(1995)中所描述的阳离子脂类；如A.V.Kabanov和V.A：Kabanov在《生物连接物化学》6：7-20(1995)中所描述的聚阳离子；如F.D.Ledley在《人类基因治疗》6：1129-1144(1995)中描述的肽和聚合物和其它非病毒基因传递系统。其它转染活性分子是由Legendre等(EP-A-95118338.3和EP-A-96100603.8)所描述的那些。
转染时，将合适量的至少一种式I的化合物添加到待转染的分子(如，质粒DNA)的水溶液中，或者反之亦然，所述式I的化合物适于以水溶液或有机溶液的形式，或者以脂质体、混合微胶粒或微胶粒的形式存在。然后可以有选择地加入阳离子脂类或任何其它的转染活性分子、辅助类脂以及(在需要时)短链磷脂，它们是水溶液或水分散液、是有机溶液和有机分散液或者以脂质体、混合微胶粒或微胶粒的形式存在。另外，可以将待转染的分子添加到包含至少一种按照本发明的化合物和(需要时)阳离子脂类或任何其它转染活性分子、辅助脂类和短链磷脂的组合物中，或者反之亦然。合适地，所述组合物是水溶液或有机溶液、水分散液和有机分散液、或脂质体、混合微胶粒或微胶粒。最终的组合物可以是液体、固体(冷冻干燥的、控制蒸发干燥的)、半固体或气溶胶。
组分，即式I化合物，待转染的分子和可有可无的附加组分之间的最佳比率取决于待转染的细胞。式I化合物和待转染的分子之间的最佳+/-电荷比率在0.1-50，优选地在0.1-10之间变化。式I化合物和附加组分(如阳离子脂类、和/或另一转染活性分子、和/或辅助脂类和/或短链磷脂)的摩尔比率是0.1-50，而优选的是0.1到10。
为了在动物和人类患者中转染细胞，可以经口服、肠胃外(i.v.，i.m.，s.c.，i.d.，i.p.)、经皮肤、肺部、鼻、直肠、眼、腔室、脉管(导管)和肿
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瘤内路线施用所述的组合物。此外，可以经高速冲击(impaction)施用将所述组合物施用到皮肤表面。可以用本领域技术人员已知的合适的试验方案测定转染进程。
另一方面，本发明涉及一些组合物，这些组合物包含至少一种式I的化合物，和可有可无的阳离子脂类或任何其它已知的转染活性分子、辅助脂类和/或短链磷脂，以及可有可无的多核苷酸或任何其它阴离子大分子。
以下用非性的实施例进一步说明本发明。 实施例1
制备其中R′是整联蛋白结合肽和A是Dab-Dab-NHNH2的式I化合物。
按基因治疗(1995)，2，552-554中描述的FMDC方案用
Wang树脂在肽合成仪SP650(Laboratec AG)上进行式II化合物(RGD-(Dab)2NHNH2)的合成。 Gly-Gly--Gly-Dab-Dab-N2H3(II)
通过肼解使肽从树脂上脱落。使形成的产物脱保护，并进行氧化环化，产生式II的化合物。
经分析型RP-HPLC证实纯化的肽的均质性，经ISP MS测定分子量：1329.5〔M+H〕，C50H81N21O16S3的计算值为1328.5。 实施例2
用250μl 10mMTrisHCl缓冲液(pH8.5)稀释10μg质粒DNA(pGL3-CMV)。然后将合适量的实施例1中获得的化合物RGD-(Dab)2NHNH2与稀释的DNA混合，以使RGD-(Dab)2NHNH2和
DNA之间的+/-电荷比率是2/1。然后将合适体积的含5μg质粒DNA的所形成的混合物添加到生长在6孔平板中的CaCo-2细胞的每孔中。24小时后测定荧光素酶活性。结果在表1中给出。 实施例3
用250μl 10mMTrisHCl缓冲液(pH8.5)稀释10μg质粒
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+
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DNA(pGL3-CaIV)。然后将合适量的由实施例1获得的化合物
RGD-(Dab)2NHNH2与稀释的DNA混合，以使RGD-(Dab)2NHNH2和DNA之间的+/-电荷比率是2/1。接着将二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)分散液添加到混合物中，使DOPE和RGD-(Dab)2NHNH2之间的摩尔比率是5/1。向生长在6-孔平板上的CaCo-2细胞的每孔添加包含5μg质粒DNA的合适体积的所形成的混合物。24小时后，测定荧光素酶活性。结果如表1所示。 表1
转染剂
实施例2实施例3
RGD(Dab)2NHNH2
RGD(Dab)2NHNH2+DOPE
每孔荧光素酶活性(相对LU)50311412
实施例4
将7nmol由实施例1获得的化合物RGD-(Dab)2NHNH2与11n
mol二油酰蜂毒肽(DO-蜂毒肽，EP-A-96,100 603.8)混合。然后将混合物加入到在200μl总体积10mM Tris HCl缓冲液(pH8.5)中的10μg质粒DNA(pGL3-CMV)中。其相当于两种转染剂的阳离子电荷与DNA阴离子电荷之间的+/-电荷比率4/1。向生长在6-孔平板中的CaCo-2细胞的每孔添加合适体积的包含5μg质粒DNA的所形成的混合物中。24小时后测定荧光素酶活性。表2显示了
RGD-(Dab)2NHNH2/DO-蜂毒肽混合物以及单独的RGD-(Dab)2NHNH2和DO-蜂毒肽的转染效率。 表2
转染剂
RGD-(Dab)2NHNH2*DO-蜂毒肽*
RGD-(Dab)2NHNH2/DO-蜂毒肽
荧光素酶活性(RLU)2506×1044×105
*按照实施例4制备 实施例5
将1.75n mol由实施例1获得的化合物RGD-(Dab)2NHNH2与5.25
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nmol脂肽Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基-丁酰)-L-(α，γ
-二氨基丁酸)酰肼(Palm-(Dab)2NHNH2)混合。然后将混合物添加到总体积200μl 10mM Tris HCl缓冲液(pH8.5)中的10μg质粒DNA(pGL3-CMV)中。其相应于两种转染剂的阳离子电荷和DNA的阴离子电荷之间的+/-电荷比率为2/1。接着将二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)分散液添加到混合物中，使DOPE的两种转染剂之间的摩尔比率是5/1。向生长在6孔平板中的CaCo-2细胞的每孔中添加合适体积的包含5μg质粒DNA的新形成的混合物。24小时后，测定荧光素酶活性。表3显示了RGD-(Dab)2NHNH2/Palm-(Dab)2NHNH2混合物以及单独的RGD-(Dab)2NHNH2和Palm-(Dab)2NHNH2的转染效率。 表3
转染剂
RGD-(Dab)NHNH*
2
2
荧光素酶活性(RLU)1×101×101×10
4
Palm-(Dab)NHNH*
2
2
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RGD-(Dab)NHNH/Pam-22(Dab)NHNH
2
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*按照实施例5制备。
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