用于制备肉毒杆菌毒素的培养基组合物[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 107002026 A(43)申请公布日 2017.08.01

(21)申请号 201680004194.X(22)申请日 2016.04.28

(30)优先权数据

10-2015-0059656 2015.04.28 KR(85)PCT国际申请进入国家阶段日

2017.06.14(86)PCT国际申请的申请数据

PCT/KR2016/004432 2016.04.28(87)PCT国际申请的公布数据

WO2016/175567 EN 2016.11.03(71)申请人 株式会社大熊

地址 韩国京畿道

(72)发明人 金敬伦　薛憓莹　闵庚旼　

权利要求书1页 说明书20页 附图11页

(74)专利代理机构 北京坤瑞律师事务所 11494

代理人 陈桉

(51)Int.Cl.

C12N 1/20(2006.01)C12P 21/02(2006.01)C12R 1/145(2006.01)

(54)发明名称

用于制备肉毒杆菌毒素的培养基组合物(57)摘要

本发明涉及用于生产肉毒杆菌毒素的培养基组合物，且更具体地，涉及用于培养能够生产肉毒杆菌毒素的梭菌属种的培养基组合物。本发明的培养基组合物包含猪蛋白胨和至少一种选自下组的植物来源的蛋白胨：豌豆水解物、棉籽水解物和小麦面筋水解物。在使用含有植物来源的蛋白胨、猪蛋白胨和矿物质的根据本发明的培养基培养肉毒梭菌时，培养基中的细菌的生长速率比目前使用的培养基和仅包含植物来源的蛋白胨的培养基之每种中的细菌生长速率高。另外，当使用本发明的培养基时，可以通过以安全的方式培养细菌生产高浓度的肉毒杆菌毒素。CN 107002026 ACN 107002026 A

权　利　要　求　书

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1.一种用于培养肉毒梭菌(Clostridium botulinum)的培养基组合物，所述培养基组合物包含：

至少一种选自下组的植物来源的蛋白胨：豌豆水解物、棉籽水解物和小麦面筋水解物；和

猪蛋白胨。

2.权利要求1的培养基组合物，其中以0.1-10w/v％的含量包含所述植物来源的蛋白胨。

3.权利要求1的培养基组合物，其中所述培养基组合物以按重量计1:0.24-43.62:0.01-50.57的比率在所述培养基组合物中包含所述豌豆水解物、所述棉籽水解物和所述小麦面筋水解物，条件是所述培养基组合物包含所述豌豆水解物、所述棉籽水解物和所述小麦面筋水解物。

4.权利要求1的培养基组合物，其中所述培养基组合物中以0.2-10w/v％的含量包含所述猪蛋白胨。

5.权利要求1的培养基组合物，其中所述猪蛋白胨是包含约54.91-60.69wt％的具有500Da以下分子量的肽的水解物，和/或包含约38.48-42.53wt％的具有500Da以下分子量的肽的水解物。

6.权利要求5的培养基组合物，其中使用以下等式1按重量计计算所述猪蛋白胨的含量，条件是所述猪蛋白胨含有包含约54.91-60.69wt％具有500Da以下的分子量的肽的水解物和包含约38.48-42.53wt％具有500Da以下的分子量的肽的水解物两者：

等式1

B≥-0.625*A+12.5,B≤-1.019*A+53其中A：包含约54.91-60.69wt％具有500Da以下的分子量的肽的水解物的含量(0-5.2w/v％)；

B：包含约38.48-42.53wt％具有500Da以下的分子量的肽的水解物的含量。7.权利要求1的培养基组合物，其中所述植物来源的蛋白胨或所述猪蛋白胨经受酶处理。

8.权利要求1的培养基组合物，其进一步包含碳源，和至少一种选自下组的矿物质：K2HPO4(磷酸氢二钾)、Na2HPO4(磷酸氢二钠)和KH2PO4(磷酸二氢钾)。

9.权利要求8的培养基组合物，其中所述培养基组合物中以0.05-3.5w/v％的含量包含所述矿物质。

10.一种用于生产肉毒杆菌毒素的方法，其包括以下步骤：

(a)使用权利要求1至9中任一项的培养基组合物培养肉毒梭菌以生产肉毒杆菌毒素；并且

(b)回收生产的肉毒杆菌毒素。11.权利要求10的方法，其中在厌氧条件下进行所述培养。12.权利要求10的方法，其中所述肉毒杆菌毒素选自下组：肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。

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用于制备肉毒杆菌毒素的培养基组合物

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发明领域

[0001]本发明涉及用于生产肉毒杆菌毒素的培养基组合物，且更具体地，涉及用于培养能够生产肉毒杆菌毒素的梭菌属(Clostridium)的菌株的培养基组合物。本发明的培养基组合物包含猪蛋白胨和至少一种选自下组的植物来源的蛋白胨：豌豆(garden pea)水解物、棉籽水解物和小麦面筋(wheat gluten)水解物。[0002]发明背景

[0003]自19世纪90年代以来，已经发现了分泌神经毒性毒素的多种梭菌属(Clostridium)菌株，并且过去70年已经进行从这些细菌分泌的毒素的表征(Schant,E.J.等,Microbiol.Rev.,56:80,1992)。

[0004]自梭菌属菌种衍生的神经毒素，即肉毒杆菌毒素，根据其血清学性质，分为七种类型(A至G型)。每种毒素具有大小约150kDa的毒素蛋白质，并且天然包含与其结合的几种无毒性蛋白质的复合物。中等复合物(300kDa)由毒素蛋白质和无毒性非血凝素蛋白组成，而大复合物(450kDa)和非常大的复合物(900kDa)由与血凝素结合的中等大小的复合物组成(Sugiyama,H.,Microbiol.Rev.,44:419,1980)。已知此类无毒性血凝素蛋白功能为保护毒素免受肠中的低pH和各种蛋白酶作用。

[0005]毒素在细胞中以具有分子量约150kDa的单一多肽合成，然后通过胞内蛋白酶的作用或用人工酶如胰蛋白酶处理从N端末端开始的1/3的位置处切割成两个单元：轻链(L；分子量：50kDa)和重链(H；分子量：100kDa)。与单个多肽相比，切割的毒素具有大大增加的毒性。两个单元通过二硫键彼此连接并具有不同的功能。重链结合靶细胞的受体(Park.M.K.等,FEMS Microbiol.Lett.,72:243,1990)，并且功能为在低pH(pH 4)与生物膜相互作用以形成通道(Mantecucco,C.等,TIBS.,18:324,1993)，并且轻链当其通过使用去污剂而可渗透细胞或通过电穿孔等导入细胞时具有干扰神经递质分泌的药理活性(Poulain,B.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,85:4090,1988)。

[0006]毒素抑制在神经肌肉接头的胆碱能前突触处的乙酰胆碱胞吐以引起虚弱。已认为甚至用非常少量的毒素的处理表现出毒性，这提示了毒素具有任何酶活性(Simpson,L.L.等,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.,26:427,1986)。[0007]根据最近的报道，毒素具有金属肽酶活性，并且其底物包括突触泡蛋白(synaptobrevin)、突触融合蛋白(syntaxin)，25kDa突触小体相关蛋白(SNAP25)等，它们是胞吐机构复合物的单元蛋白质。每种类型的毒素使用上述三种蛋白质之一作为其底物，并且已知B、D、F和G型毒素在特定位点处切割突触泡蛋白，A和E型毒素在特定位点处切割SNAP25，并且C型在特定位点处切割突触融合蛋白(Binz,T.等,J.Biol.Chem.,265:9153,1994)。

[0008]特别地，已知A型肉毒杆菌毒素可溶于pH 4.0-6.8的稀水溶液中。已知稳定的无毒性蛋白质在约7以上的pH与神经毒素分离，并且因此毒性逐渐丧失。特别地，已知毒性随着pH和温度升高而降低。

[0009]肉毒杆菌毒素即使少量也是对人体致命的，并且容易大量生产。因此，它与炭疽芽

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孢杆菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)和天花病毒(smallpox virus)一起构成四大生物恐怖武器。然而，发现当A型肉毒杆菌毒素以不系统地影响人体的剂量注射时，它可以使注射部位中的局部肌肉瘫痪。基于这一特点，A型肉毒杆菌毒素可用于宽范围的应用，包括除皱剂(winkle removing agent)、治疗痉挛性偏瘫和大脑性瘫痪的药剂等。因此，对A型肉毒杆菌毒素的需求已经增加，并已经积极开展关于生产肉毒杆菌毒素的方法的研究以满足需求。

[0010]

目前典型的商业产品是可从Allergan,Inc.,USA商购的(A型肉毒杆菌

毒素的纯化神经毒素复合物)。100单位的小瓶由约5ng的A型肉毒杆菌毒素的纯

(肉毒梭

化神经毒素复合物、0.5mg人血清白蛋白和0.9mg氯化钠组成，并使用无防腐剂的无菌盐水(0.9％氯化钠注射液)重建。其它商业产品包括可购自Ipsen Ltd.,UK的

菌A型毒素和血凝素的复合物，其在含有肉毒杆菌毒素的药物组合物中具有乳糖和人血清白蛋白，并且在使用前使用0.9％氯化钠重建)，可购自Solstice Neurosciences,Inc的

(包含B型毒素毒素、人血清白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠的可注射溶液(约5.6的

pH))。

用于培养肉毒梭菌的培养基含有动物成分，所述培养基通常用于生产肉毒杆菌毒素的方法，如韩国专利No.10-1339349中公开。因此，如果称为引起传染性海绵状脑病的作用剂的动物异常朊病毒由于污染而被包含在动物成分中，则它在用于生产肉毒杆菌毒素的过程中造成问题。

[0012]传染性海绵状脑病(TSE)称为导致神经元严重变性的神经变性性疾病，并且其实例包括牛海绵状脑病(BSE)、羊瘙痒症(Scrapie)、克罗伊茨费尔特-雅各布(Creutzfeldt-Jakob)病(CJD)、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克(Gerstmann-Straussler-Scheinker)综合征、库鲁病(Kuru)、传染性水貂脑病(transmissible mink encephalopathy)、慢性消耗性疾病(chronic wasting disease)、猫海绵状脑病(feline spongiform encephalopathy)等，其影响人和动物。报道了BSE通过物种屏障，甚至传染人类。[0013]引起传染性海绵状脑病(TSE)的作用剂具有的特征在于它没有免疫原性，并且潜伏期(incubation period)长。从BSE影响的牛脑组织的组织病理学分析可以看出，由于对神经元的损伤和异常蛋白质纤维的沉积，脑中形成了特殊的海绵状空泡。[0014]TSE的原因是称为异常朊病毒的蛋白质性感染性颗粒。与需要核酸的一般病毒不同，异常朊病毒是由不含核酸的单独蛋白质组成的感染性颗粒。关于TSE，已知当作为感染性颗粒的异常朊病毒(PrPsc)与正常朊病毒(PrPc)结合时，将其转化为病原性朊病毒，然后将其积聚在脑中(Prusiner SB,Alzheimer Dis Assoc Disord.,3:52-78,19)。

[0015]克罗伊茨费尔特-雅各布病是一种罕见的人类传染性海绵状脑病(TSE)的神经变性性疾病，其中传染原显然是朊病毒蛋白的异常亚型(isoform)。在六个月内，具有克罗伊茨费尔特-雅各布病的个体可从表面完全健康状况恶化到运动不能性缄默(akinetic mutism)。因此，可存在从含有使用动物来源的产品获得的生物制剂如肉毒杆菌毒素的药物组合物的施用中获得朊病毒介导的疾病(如克雅氏综合征)的潜在风险。因此，如果药物组合物由使用动物来源的成分生产的药物物质制备，则它可使患者受到接受各种病原体或传染原的潜在风险。

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在此技术背景下，本发明人已发现，当将包含无传染性海绵状脑病(TSE)的植物来

源的蛋白胨、矿物质和无TSE的猪蛋白胨(例如TSE认证的猪蛋白胨)的培养基用于肉毒梭菌的培养以防止发生上述朊病毒介导的疾病的风险时，可排除发生可在目前使用的培养基(初始培养基)中存在的朊病毒介导的疾病的风险，并且肉毒梭菌在该培养基中的生长速率与目前使用的培养基和仅包含植物来源的蛋白胨的培养基中的肉毒梭菌的生长速率相比可为增加的，由此完成本发明。[0017]发明概述[0018]技术问题

[0019]本发明的目的是提供培养基组合物，其包含没有传染性海绵状脑病(TSE)感染风险的植物来源的蛋白胨和没有TSE感染风险的猪蛋白胨，以及生产肉毒杆菌毒素的方法，其通过在培养基组合物中培养肉毒梭菌来改善肉毒杆菌毒素的生产。[0020]技术方案

[0021]为了实现上述目的，本发明提供了用于培养肉毒梭菌的培养基组合物，所述培养基组合物包含：至少一种选自下组的植物来源的蛋白胨：豌豆水解物、棉籽水解物和小麦面筋水解物；和猪蛋白胨。

[0022]本发明还提供用于生产肉毒杆菌毒素的方法，包括以下步骤：(a)使用所述培养基组合物培养肉毒梭菌以生产肉毒杆菌毒素；并且(b)回收生产的肉毒杆菌毒素。[0023]附图简述

[0024]图1显示了包含植物来源的蛋白胨的培养基(APF培养基)中肉毒梭菌的生长。[0025]图2显示了在包含植物来源的蛋白胨、矿物质、氨基酸和维生素的培养基中肉毒梭菌的生长。

[0026]图3显示检查包含植物来源的蛋白胨、矿物质、氨基酸和维生素的培养基灭菌后是否形成沉淀物的结果。

[0027]图4显示检查含有植物来源的蛋白胨和矿物质的培养基灭菌后是否形成沉淀物的结果。

[0028]图5显示通过对用于培养细菌的培养基(其含有植物来源的蛋白胨和矿物质)另外添加维生素、氨基酸和“无葡萄糖和L-谷氨酰胺的BD RechargeTM”获得的培养基中的肉毒梭菌的生长。

[0029]图6显示了用于培养细菌的培养基(其含有各种种类的植物来源的蛋白胨)中肉毒梭菌的生长。

[0030]图7显示了用于矿物质筛选的FFD等值线图和响应优化。图7a高设置的等值线图；图7b中间设置的等值线图；图7c低设置的等值线图；和图7d最大OD的响应优化。[0031]图8显示了用于矿物质筛选的FFD等值线图和响应优化。图8a高设置的等值线图；图8b中间设置的等值线图；图8c低设置的等值线图；和图8d最大OD的响应优化。[0032]图9显示了用于植物蛋白胨筛选的等值线图和响应优化。图9a中间设置的等值线图；图9b低设置的等值线图；和图9c最大OD的响应优化。

[0033]图10显示了最终选择的APF培养基中肉毒梭菌的生长曲线，和毒素浓度的变化。[0034]图11a显示了响应表面图和响应优化，并且图11b用于筛选猪蛋白胨Primatone P37或细菌用

蛋白胨No.3。

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图12以图形显示了比较目前使用的培养基、包含植物来源的蛋白胨的培养基(APF

培养基)和包含植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨的最终培养基(APF+猪)之间肉毒梭菌生长的时间依赖性OD值。

[0036]实施发明的最佳方式[0037]在本发明中，无动物蛋白质(APF)的培养基组合物显示与目前使用的培养基(初始培养基)相比增加的肉毒梭菌生长速度，但是不考虑添加进一步增加细菌的生长速率的培养基组分，并且没有TSE等感染的风险。因此，将尚未报告引起TSE感染的猪蛋白胨(例如TSE认证的猪蛋白胨)添加到APF培养基，并检查APF培养基中细菌的生长。因此，与目前使用的培养基和仅包含植物来源的蛋白胨的培养基相比，上述培养基显示细菌生长速度增加。结果，如果使用APF培养基，则可以通过在无TSE的条件下以安全的方式培养细菌来生产高浓度的肉毒杆菌毒素。

[0038]报告了TSE影响人和各种动物，包括山羊、绵羊、貂和鹿，但是尚未报告猪中的TSE爆发(Jahns H等,Vet Rec.,159(5):137-142,2006；Kofler M等,Schwweiz Arch Tierheild,148(7):341-342,344-348,2006)。因此，在本发明中，将猪蛋白胨添加至用于培养肉毒梭菌的培养基组合物，由此制备培养基组合物，该培养基组合物与目前使用的培养基和仅包含植物来源的蛋白胨的培养基相比在用于生产生物剂，如肉毒杆菌毒素而无引起朊蛋白介导的疾病如克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jacob disease)的风险的方法中显示增加的细菌生长速率。[0039]如本文中所用，术语“目前使用的培养基或初始培养基”意指包含酪蛋白水解物、酵母提取物和硫代乙醇酸盐培养基(其为动物来源的培养基成分)的培养基。术语“APF培养基(无动物蛋白质培养基)”意指不含动物来源的蛋白质，并且含有植物来源的蛋白胨、矿物质和葡萄糖的培养基。

[0040]在本发明的实例中，为了通过在无传染性海绵状脑病(TSE)的条件下培养肉毒梭菌来生产肉毒杆菌毒素，制备包含无TSE的植物来源的蛋白胨的APF培养基，并且与目前使用的培养基(含有动物成分)比较。结果，可以看出，用于培养肉毒梭菌的最佳培养基组合物是包含植物来源的蛋白胨、至少一种选自KH2PO4、K2HPO4和Na2HPO4的矿物质，和碳源(例如葡萄糖)的培养基，并且发现该培养基中细菌的最佳生长。结果，如表13中所示，确定了用于培养肉毒梭菌的最终选择的培养基组合物中的植物来源的蛋白胨的最佳含量为5g/L Hy-PeaTM7404、10g/L UltraPepTM棉和5g/L HyPepTM4601N，并且培养基组合物中矿物质的最佳含量为5.5g/L K2HPO4和3g/L Na2HPO4。[0041]在本发明的另一个实例中，测量含有植物来源的蛋白胨和矿物质的最终选择的APF培养基中的肉毒梭菌的生长模式和毒素浓度。结果，如表12和图10中所示，肉毒梭菌的12小时培养后OD值开始增加，并且培养24小时时，培养基显示3.5465的OD540nm和3.0695的OD600nm。然后，OD值逐渐降低，并且在培养的48小时时，培养基显示0.792的OD540nm和0.7224的OD600nm。肉毒梭菌培养上清液中的毒素浓度在培养5小时后开始增加，并且显示了31.41μg/ml的最终值。当破裂细菌后测量毒素浓度时，培养5小时后开始生产毒素，并且毒素浓度持续增加，培养28小时后维持于一致的水平，并且显示38.39μg/ml的最终值。[0042]在本发明的另一个实例中，检查包含植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨的培养基中的肉毒梭菌生长。结果，如表14中所示，当在进一步包含猪蛋白胨的培养基中培养细菌时，培

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养基显示比仅包含植物来源的蛋白胨的培养基高的OD值。特别地，显示最高的细菌生长速率的培养基是包含10g/L Primatone P37和10g/L细菌用

蛋白胨No.3的培养基，其显示

OD540nm值4.951。

[0043]在本发明的另一个实例中，检查包含植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨的培养基中的肉毒梭菌的生长模式。结果，如表15中所示，在培养菌株的20小时时，包含植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨的培养基中的细菌生长是活跃的，并且培养基显示为商业培养基的OD值的约11倍高且为仅包含植物来源的蛋白胨的培养基的OD值的约2.2倍高的OD值。在培养细菌的29小时时，包含植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨的培养基的峰OD值为目前使用的培养基和仅包含植物来源的蛋白胨的培养基之每种的峰OD值的至少2倍高。因此，可以看出包含植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨的培养基中的细菌生长速率在三类培养基中的那些中是最高的。[0044]结果，如表16中所示，确定了最终选择的用于培养肉毒梭菌的培养基组合物(其含有无传染性海绵状脑病(TSE)的猪蛋白胨)中植物来源的蛋白胨的最佳含量是5g/L Hy-PeaTM7404、10g/L UltraPepTM棉和5g/L HyPepTM4601N，并且培养基组合物中的最佳矿物质含量是5.5g/L K2HPO4和3g/L Na2HPO4，葡萄糖的含量是10g/L，并且猪蛋白胨的含量是13g/L Primatone P37和13g/L细菌用

[0045]

蛋白胨No.3。

因此，一方面，本发明涉及用于培养肉毒梭菌的培养基组合物，所述培养基组合物包含：至少一种选自下组的植物来源的蛋白胨：豌豆水解物、棉籽水解物和小麦面筋水解物；和猪蛋白胨。

[0046]如本文中所用，术语“植物来源的蛋白胨”意指从豌豆、棉籽或面筋提取的蛋白胨。优选地，植物来源的蛋白胨可为可商购的Hy-PeaTM7404、UltraPepTM棉、HyPepTM7504或HyPepTM4601N，但不限于此。术语“猪蛋白胨”意指从猪组织提取的组分。优选地，猪蛋白胨可以是包含约54.91-60.69wt％具有500Da以下分子量的肽的猪蛋白胨，或包含约38.48-42.53wt％具有500Da以下分子量的肽的猪蛋白胨。更优选地，酪蛋白水解物可为商品化的Primatone P37或细菌用

[0047]

蛋白胨No.3，但是不限于此。

如本文中所用，术语“植物来源的蛋白胨”或“植物来源的水解物”意指通过降解从植物分离的蛋白质而获得的产物。例如，豌豆蛋白胨(豌豆水解物)意指通过降解从豌豆中分离的总蛋白而获得的产物。另外，术语“猪蛋白胨”或“猪水解物”意指通过降解猪蛋白质获得的产物。

[0048]植物来源的蛋白质或猪组织蛋白质的降解优选通过部分消化来进行。蛋白质的降解优选通过酸处理、碱处理、酶处理、高压处理、热处理或物理处理进行。更优选地，猪蛋白胨可以是通过酶处理获得的。物理处理是例如研磨。[0049]用于本发明的植物来源的蛋白胨或猪蛋白胨是蛋白质的部分降解产物，是不仅包含作为单一分子的氨基酸，而且还包含由几至数十个氨基酸组成的肽，和完整的蛋白质分子的混合物。

[0050]在本发明中，培养基组合物中植物来源的蛋白胨的含量可为0.1-10w/v％(1-100g/L)，优选0.2-5w/v％(2-50g/L)，更优选0.5-2w/v％(5-20g/L)。[0051]在本发明中，培养基组合物包含所有豌豆水解物、棉籽水解物和小麦面筋水解物，并且培养基组合物中豌豆水解物、棉籽水解物和小麦面筋水解物的含量比可为按重量计1:0.24-43.62:0.01-50.57，优选按重量计1:0.68-14.46:0.09-9.87，更优选按重量计1:1.6-7

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2.4:0.6-1.4。

[0052]在本发明中，培养基组合物中的猪蛋白胨的含量可为0.2-10w/v％(2-100g/L)，优选0.4-5w/v％(4-50g/L)，更优选1-2w/v％(10-20g/L)。[0053]在本发明中，猪蛋白胨可为包含约54.91-60.69wt％具有500Da以下的分子量的肽的水解物和/或包含约38.48-42.53wt％具有500Da以下的分子量的肽的水解物。[0054]在本发明中，若猪蛋白质含有包含约54.91-60.69wt％具有500Da以下的分子量的肽的水解物和包含约38.48-42.53wt％具有500Da以下的分子量的肽的水解物两者，则可使用以下等式1计算所述猪蛋白胨的含量(按重量计)，并且包含约54.91-60.69wt％具有500Da以下的分子量的肽的水解物和包含约38.48-42.53wt％具有500Da以下的分子量的肽的水解物的含量比率可以按重量计优选为1:0.8-1.2。[0055]等式1

[0056]B≥-0.625*A+12.5，B≤-1.019*A+53[0057]其中[0058]A：包含约54.91-60.69wt％具有500Da以下的分子量的肽的水解物的含量(0-5.2w/v％(0-52g/L))；[0059]B：包含约38.48-42.53wt％具有500Da以下的分子量的肽的水解物的含量(0-5.3w/v％(0-53g/L))。[0060]在本发明中，用于培养肉毒梭菌的培养基组合物还可以含有碳源和至少一种选自K2HPO4(磷酸氢二钾)、Na2HPO4(磷酸二氢钠)和KH2PO4(磷酸二氢钾)的矿物质。[0061]在本文中，碳源的实例包括但不限于单糖(例如葡萄糖，果糖等)、二糖(例如麦芽糖，蔗糖等)、寡糖、多糖(例如糊精、环糊精、淀粉等)，糖醇(例如，木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等)。

[0062]在本发明中，培养基组合物中矿物质的含量可为0.05-3.5w/v％(0.5-35g/L)，优选0.1-1.75w/v％(1-17.5g/L)，且更优选0.25-0.7w/v％(2.5-7g/L)。[0063]另一方面，本发明涉及用于生产肉毒杆菌毒素的方法，包括以下步骤：(a)使用上述培养基组合物培养肉毒梭菌以生产肉毒杆菌毒素；并且(b)回收生产的肉毒杆菌毒素。[00]在本发明中，培养可以在厌氧条件下进行，并且肉毒杆菌毒素可以选自A、B、C、D、E、F、G型的肉毒杆菌毒素。实施例

在下文中，参照实施例，更详细描述本发明。对于本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅仅是示例性的目的，而不应解释为本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同方案来限定。[0066]实施例1：在植物来源的蛋白胨培养基中培养肉毒梭菌[0067]1-1：目前用于培养的培养基的组成[0068]用于本发明的试剂和培养基组分购自Sigma(USA)、Kerry Inc.(USA)、BD Biosciences(USA)、Gibco Life Technologies(USA)和Quest(USA)。

[0069]使用目前使用的培养基进行肉毒梭菌的种子培养和主培养以生产肉毒杆菌毒素，所述培养基具有包含2％酪蛋白水解物(20g/L)、1％酵母提取物(10g/L)、1％葡萄糖(10g/

[0065]

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L)和0.5％硫代乙醇酸盐培养基(5g/L)的组合物。每升目前使用的培养基的5g硫代乙醇酸盐培养基由2.52g酪蛋白的酶消化物、0.84g酵母提取物、0.925g右旋糖、0.085g硫代乙醇酸钠、0.42g NaCl、0.085g L-半胱氨酸，0.00014g刃天青(Resazurin)和0.125g细菌学琼脂组成。

[0070]1-2：培养中使用的APF培养基的组成

[0071]通过从目前用于培养肉毒梭菌的培养基(初始培养基)中除去酪蛋白水解物、酵母提取物和硫代乙醇酸盐培养基来制备阴性对照培养基，并且通过将四种植物来源的蛋白胨候选物(Hy-PeaTM7404、UltraPepTM棉、HyPepTM7504、和HyPepTM4601N)添加到阴性对照培养基中制备无动物蛋白质(APF)培养基(表1)。

[0072]表1显示了与目前使用的培养基相比，用于培养肉毒梭菌的包含植物来源的蛋白胨的APF培养基的组分。[0073]表1

[0074]

1-3：肉毒梭菌的种子培养

[0076]将20μl肉毒梭菌(韩国疾病预防控制中心登记号：4-029-CBB-IS-001)接种到含有10ml无菌培养基的培养管中，所述无菌培养基具有实施例1-1和1-2中描述的每种组成，并在35℃在厌氧条件下进行初级种子培养(静止培养)22-30小时。当确认了初级种子培养物中的细菌生长时，将8ml初级种子培养物接种到含有800ml具有相同培养基组成的无菌培养基的1升培养瓶中，并在35℃下在厌氧条件下进行二次种子培养(静止培养)8-15小时。[0077]1-4：肉毒梭菌的主培养

[0078]为了通过培养肉毒梭菌生产肉毒杆菌毒素，进行细菌的主培养。具体地，制备9.3L具有实施例1-1和1-2中所述的每种组成的培养基，并置于10升培养箱中，然后对培养基灭菌。供给氮以产生厌氧条件，并且在35℃的温度和50rpm的搅拌速度下进行细菌的生长。[0079]通过与10升培养箱的接种口连接的接种线将实施例1-3中的1升培养瓶中的二次种子培养物接种到10升培养箱中。在35℃和50rpm的条件下培养10升培养箱中的肉毒梭菌，监测并记录设定的培养条件。当将细菌培养100小时以上时，终止主培养。[0080]通过将四种植物来源的蛋白胨候选物(Hy-PeaTM7404、UltraPepTM棉、HyPepTM7504和HyPepTM4601N)添加到阴性对照中制备的无动物蛋白质(APF)培养基中的肉毒梭菌的生长与通过从目前使用的培养基(初始培养基)(表1)中除去酪蛋白水解物、酵母提取物和硫代乙醇酸盐培养基制备的阴性对照培养基中的细菌生长比较。[0081]因此，如表1和图1中所示，肉毒梭菌在阴性对照培养基中未生长，但在接种细菌后

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[0075]

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24小时开始在初始培养基(目前使用的培养基)中生长，并且在接种细菌后30小时开始在含有植物来源的蛋白胨的培养基中生长。[0082]实施例2：在含有植物来源的蛋白胨、矿物质、氨基酸和维生素的培养基中培养肉毒梭菌

[0083]由于在实施例1中通过添加四种植物来源的蛋白胨制备的培养基中的肉毒梭菌的生长比初始培养基中的肉毒梭菌的生长慢，如下提供了其解决方案。[0084]1)为了检查功能为产生厌氧条件的硫代乙醇酸盐的效果，从初始培养基(目前使用的培养基)中除去硫代乙醇酸盐，并且分析无硫代乙醇酸盐的培养基中细菌生长速率的变化。

[0085]2)由于较慢的生长速率可以是由于氮源缺乏所致，将用于细菌培养的培养基中的蛋白胨浓度增加2倍。

[0086]3)将通过将矿物质、氨基酸和维生素添加到含有植物来源的蛋白胨的培养基获得的培养基中的肉毒梭菌的生长与美国专利No.8,012,716(Allergan)中公开的APF培养基(表2)中的肉毒梭菌的生长比较。

[0087]表2显示了用于培养肉毒梭菌的培养基的成分，其含有植物来源的蛋白胨、矿物质、氨基酸和维生素。[0088]表2

[00]

[0090]

结果，如表2和图2中所示，当在目前使用的不含硫代乙醇酸盐的培养基中培养细

菌时，培养基中细菌的生长速度比含硫代乙醇酸盐培养基中的生长速度慢，指示硫代乙醇酸盐影响细菌的生长速率。当将培养基中的蛋白胨浓度增加两倍时，细菌在培养基中不生长。当对含有蛋白胨的培养基添加矿物质成分、氨基酸和维生素的情况下，细菌的生长速度

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与目前使用的培养基中细菌的生长速度相似，但培养基灭菌后形成沉淀物。此外，看到Allergan的APF培养基中细菌的生长速度与目前使用的培养基中细菌的生长速度相似。[0091]实施例3：通过灭菌含有植物来源的蛋白胨、矿物质、氨基酸和维生素的培养基产生沉淀物

[0092]在实施例2中，观察到表2中所示的APF培养基候选物2至4中含有植物来源的蛋白胨、矿物质、氨基酸和维生素的培养基中的肉毒梭菌的生长速度与目前使用的培养基中的肉毒梭菌的生长速度相似。然而，在培养基灭菌后出现沉淀物的形成，因此检查其原因(表3)。

[0093]表3显示了在灭菌中使用并含有植物来源的蛋白胨、矿物质、氨基酸和维生素的用于培养肉毒梭菌的培养基的组分。[0094]表3

[0095]

结果，如表3和图3中所示，仅在对含有植物来源的蛋白胨的培养基添加矿物质的

情况下，培养基灭菌后才形成沉淀物，指示沉淀物形成的主要原因为矿物质。这被认为是因为在培养基灭菌期间在高温和高压条件下，矿物质成分相互作用。[0097]实施例4：通过灭菌含有植物来源的蛋白胨和矿物质的培养基形成沉淀物

[0098]为了鉴定如实施例3中确认的通过灭菌引起的沉淀物形成中牵涉的矿物质成分，将不同成分的各种组合添加到培养基中，然后灭菌(表4)。

[0099]表4显示了含有植物来源的蛋白胨和矿物质的用于培养肉毒梭菌的培养基的成分，以及培养基灭菌的结果。[0100]表4

[0096]

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[0101]

结果，如表4和图4中所示，在含有植物来源的蛋白胨和矿物质的培养基中，含有

MgSO4·7H2O和K2HPO4的培养基以及含有MgSO4·7H2O和Na2HPO4的培养基在灭菌后形成沉淀物。

[0103]实施例5：在APF培养基中不形成沉淀物的条件下培养肉毒梭菌

[0104]当将维生素和氨基酸另外添加到含有植物来源的蛋白胨和矿物质的实施例4的APF培养基中时，进行实验来确定肉毒梭菌的培养是否可能。此外，进行实验以检查细菌的培养在不含植物来源的蛋白胨和矿物质并含有维生素、氨基酸和/或“不含葡萄糖和L-谷氨酰胺的BD Recharge TM”(产品目录编号670002，BD Bioscience)(不含葡萄糖和L-谷氨酰胺的基于酵母提取物的培养基成分)的培养基中是否可能(表5)。

[0105]表5显示通过对含有植物来源的蛋白胨和矿物质的用于培养肉毒梭菌的培养基另外添加维生素、氨基酸和“不含葡萄糖和L-谷氨酰胺的BD RechargeTM”获得的培养基组分，以及细菌在培养基中的生长速度。[0106]表5

[0102]

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[0107]

结果，如表5和图5中所示，仅在含有植物来源的蛋白胨和KH2PO4、K2HPO4和Na2HPO4

的两种或更多种矿物质的组合以及进一步含有维生素和氨基酸的培养基的情况下，肉毒梭菌在细菌接种后24小时内生长。此外，在培养基不含植物来源的蛋白胨和矿物质并含有维生素、氨基酸和“不含葡萄糖和L-谷氨酰胺的BD RechargeTM”的情况下，细菌在细菌接种后48小时内生长。总之，对于培养肉毒梭菌的最合适的培养基组合物包括植物来源的蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、氨基酸和维生素。[0109]实施例6：在含有不同植物来源的蛋白质的培养基中培养肉毒梭菌

[0110]进行实验以检查当在对实施例5的APF培养基添加植物来源的蛋白胨的不同组合时肉毒梭菌的培养是否可能。

[0111]表6显示了含有不同植物来源的蛋白胨的用于培养肉毒梭菌的培养基的成分，以及检查细菌是否在培养基中生长的结果。[0112]表6

[0108]

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[0113]

结果，如表6和图6中所示，即使在对培养基添加四种植物来源的蛋白胨中仅一种

或两种时，肉毒梭菌的培养是可能的。[0115]考虑到实施例5和6的结果，可以看出培养基中应该含有至少一种植物来源的蛋白胨，并且植物来源的蛋白胨不能用“不含葡萄糖和L-谷氨酰胺的BD RechargeTM”(产品目录编号670002，BD Bioscience)(不含葡萄糖和L-谷氨酰胺的基于酵母提取物的培养基成分)替代。

[0116]实施例7：用于选择培养基中含有的三种矿物质中的两种的实验[0117]在实施例1至7中，确定用于肉毒梭菌培养的APF培养基组合物包含葡萄糖、氯化钠(NaCl)、四种植物来源的蛋白胨、三种矿物质、氨基酸和维生素。在这些培养基成分中，除去对细菌生长没有显著影响的培养基成分，以减少培养基成分的数目。因此，判断氨基酸和维生素对肉毒梭菌的生长没有显著影响，并且在此判断下，从培养基成分中除去氨基酸和维生素。另外，为了从三类矿物质中选出两种，使用表7中所示的培养基组合物培养细菌，并测量接种细菌后24小时和48小时的OD(540nm和600nm)值并比较。

[0118]表7显示了源自矿物质的第一阶段选择的培养基的组成和培养基中肉毒梭菌的生长。

[0119]表7

[0114]

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[0120]

结果，如表7中所示，在细菌接种后24小时，目前使用的培养基显示0.942的OD

(540nm)值，并且含有K2HPO4和Na2HPO4的APF培养基显示APF培养基中的4.9的最高OD(540nm)值。另外，在细菌接种后48小时，含有KH2PO4和Na2HPO4的APF培养基显示最高的OD值和活跃的细菌生长。[0122]同时，如图7中所示，绘出了具有高主效应的K2HPO4和Na2HPO4的等值线图。结果，随着K2HPO4和Na2HPO4的浓度增加，OD值增加。并且，当以KH2PO4＝0g/L、K2HPO4＝5.5g/L、和Na2HPO4＝5g/L的浓度将矿物质添加到培养基时，肉毒梭菌显示最高的生长。[0123]同时，为了根据更精确的矿物质添加来确认细菌培养结果，使用响应面法进行第二阶段实验。由于培养基组合物不能具有负值，使用CCF(中心复合面)设计计划实验，并且通过在表8中所示的培养基组合物中培养细菌来进行。然后，将实验结果与先前进行的FFD的结果组合并且进行统计分析。

[0124]表8显示了通过矿物质的第二阶段选择获得的培养基的组成和培养基中肉毒梭菌的生长。[0125]表8

[0121]

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[0126]

[0127]

绘制等值线图并用于比较。如图8中所示，随着KH2PO4浓度降低，OD值增加。当比较

最佳条件时，结果由于曲率效应而与FFD的结果不同，并且K2HPO4的值相同，但是Na2HPO4的值从5g/L变化为3.1313g/L。因此，通过统计分析确认了培养基的最佳矿物质条件为5.5g/L K2HPO4和3g/L Na2HPO4。[0128]实施例8：用于选择培养基中含有的植物来源的蛋白胨的实验[0129]如表9和表10所示，根据混合物设计合并植物来源的蛋白胨，并检查含有组合的植物来源的蛋白胨的培养基中肉毒梭菌的生长。

[0130]表9显示了通过第一阶段选择植物来源的蛋白胨所获得的培养基的组成和使用培养基的肉毒梭菌的生长。[0131]表9

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[0132]

表10显示了通过植物来源的蛋白胨的第二阶段选择获得的培养基的组成合使用

培养基的肉毒梭菌的生长。[0134]表10

[0133]

[0135]

结果，如图9中所示，绘制等值线图并用于比较。确定对应于组分C的HyPepTM7504对

肉毒梭菌的生长具有最低的影响。基于此测定，从培养基组分排除HyPepTM7504。总之，确定培养基中含有的最终选择的植物来源的蛋白胨的组成包含5g/L Hy-PeaTM7404、10g/L UltraPepTM棉和5g/L HyPepTM4601N。[0137]实施例9：含有NaCl或不含NaCl的培养基中的肉毒梭菌的培养[0138]实施例1至8中使用的培养基组合物含有少量(0.5g/L)NaCl。为了根据NaCl的浓度变化检查肉毒梭菌的生长，将培养基中NaCl的含量调节至0至1g/L的范围，然后在培养基中

[0136]

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培养细菌。

[0139]表11显示了用于培养肉毒梭菌的含有NaCl的培养基的组成和培养基中肉毒梭菌的生长。[0140]表11

[0141]

因此，如图11a和11b中所示，无论培养基含有NaCl与否，细菌的生长没有差异。因

此，从最终的APF培养基成分中排除NaCl。[0143]实施例10：测量最终选择的APF培养基中肉毒梭菌的生长模式和毒素浓度

[0144]将肉毒梭菌接种到基于实施例1至9的结果确定的最终选择的肉毒梭菌培养基(10g/L葡萄糖、5g/L Hy-PeaTM7404、10g/L UltraPepTM棉、5g/L HyPepTM4601N、5.5g/L K2HPO4、和3g/L Na2HPO4)，然后测量细菌的生长模式和毒素浓度。

[0145]表12显示了在最终选择的APF培养基中生长的肉毒梭菌的时间依赖性OD值和毒素浓度。

[0146]表12

[0142]

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[0147]

结果，如表12和图10中所示，在培养肉毒梭菌12小时后OD值开始增加，并在培养24

小时培养基显示3.5465的OD540nm和3.0695的OD600nm。然后，OD值逐渐降低，并且在培养48小时，培养基显示0.792的OD540nm和0.7224的OD600nm。肉毒梭菌上清液中的毒素浓度在培养24小时后开始增加，并且显示最终值31.41μg/ml。当破裂细菌后测量毒素浓度时，培养5小时后开始生产毒素，并且毒素浓度持续增加，培养28小时后维持于一致的水平，并且显示最终值38.39μg/ml。[0149]总之，在表13中汇总了基于实施例1至10的结果确定的最终选择的APF(无动物蛋白质的培养基)组成。[0150]表13

[0148]

[0151]

实施例11：含有植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨的培养基中肉毒羧基的生长

[0153]虽然经由实施例1至10确定的APF培养基组合物与目前使用的培养基相比显示增加的细菌生长速率，但是考虑添加进一步提高细菌生长速率并且没有引起TSE感染等的风险的培养基组分。结果，将尚未报告引起TSE感染的猪蛋白胨添加至APF培养基，并且检查所得的培养基中的细菌生长。

[0154]将一种或两种无TSE的猪蛋白胨添加至基于实施例1至10的结果确定的APF培养

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[0152]

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基。具体地，在含有植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨Primatone P37和/或细菌用蛋白胨No.3的培养基组合物中将肉毒梭菌培养24小时和48小时，并且通过测量培养期间的OD(540nm,600nm)值检查细菌的生长(表14)。另外，使用统计学程序将测量结果进行统计学分析，由此选择在培养细菌24小时显示最高生长的培养基组合物。[0155]表14显示了用于培养肉毒梭菌的培养基的组分，所述培养基含有植物来源的蛋白胨、矿物质和猪蛋白胨。[0156]表14

[0157]

[0158]

结果，如表14中所示，当在进一步含有猪蛋白胨的培养基中培养细菌时，培养基显

示比仅含有植物来源的蛋白胨的培养基的OD值高的OD值。特别地，显示最高的细菌生长速率的培养基是含有10g/L Primatone P37和10g/L细菌用

蛋白胨的培养基，其显示OD540nm

值4.951。

[0159]同时，为了确定可以最大化细菌生长的条件，将实验延伸到响应表面方法，并且将响应表面方法的结果使用统计学程序进行统计学分析。另外，如图11(A)中所示，绘制响应等值线图，且结果，在实验范围中找到可最大化细菌生长的条件。此外，计算可最大化细菌生长的条件。结果，如图11(B)中所示，含有13.131g/L Primatone P37和12.727g/L细菌用蛋白胨No.3的培养基显示OD540nm值4.8718，其对应于最高的细菌生长速率。为了方便培养基组合物，在随后的实验中以13g/L的量使用每种额外的组分。[0160]实施例12：含有植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨的培养基中肉毒羧基的生长模式[0161]使用实施例1至11中确定的含有植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨的培养基组合物，培养肉毒梭菌，并且检查培养基中细菌的生长模式(见表15)。[0162]表15显示了比较目前使用的培养基、包含植物来源的蛋白胨的培养基(APF培养基)和包含植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨的最终培养基(APF+猪)之间肉毒梭菌生长的时间依赖性OD值。[0163]表15

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[01]

结果，如表15和图12中所示，在培养菌株的20小时，包含植物来源的蛋白胨和猪蛋

白胨的培养基中的细菌生长是活跃的，并且培养基显示为目前使用的培养基的OD值的约11倍高且为仅包含植物来源的蛋白胨的培养基的OD值的约2.2倍高的OD值。在培养细菌的29小时，包含植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨的培养基的峰OD值为目前使用的培养基和仅含有植物来源的蛋白胨的培养基之每种的峰OD值的至少2倍高。因此，可以看出含有植物来源的蛋白胨和猪蛋白胨的培养基中的细菌生长速率在三种培养基中的那些中是最高的。[0166]总之，基于实施例11和12的结果，表16中显示了除了无动物蛋白质(APF)的培养基外包含猪蛋白胨的最终选择的组合物。[0167]表16

[0165]

[0168]

[0169]

工业实用性

[0170]如上所述，当将含有植物来源的蛋白胨、猪蛋白胨和矿物质的根据本发明的培养基用于肉毒梭菌的培养时，培养基中细菌的生长速度比目前使用的培养基和仅含有植物来源的蛋白质的培养基之每种中的细菌的生长速度高。此外，当使用本发明的培养基时，可通过以安全的方式培养细菌来生产高浓度的肉毒杆菌毒素。[0171]尽管已经参照具体特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员将显而易见

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的是，本说明书仅针对优选实施方案，而并不本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同方案来限定。

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