2017蛋白质组学划考点整合

4、亚细胞蛋白质组学：亚细胞蛋白质组学是以亚细胞结构如亚细胞区室、特定蛋白质组分、细胞器等所包含的所有蛋白质为研究对象的一个蛋白质组学的分支学科。

9、蛋白质组学的研究主要可以分为哪三大分支?各分支的研究侧重点是什么? 蛋白质组学按层次分类：表达蛋白质组学、结构蛋白质组学、功能蛋白质组学。

（1）表达蛋白质组学：研究某种细胞或组织中蛋白质表达的整体变化。即机体在生长、发育、疾病和死亡的不同阶段中，细胞与组织的蛋白质表达图谱的变化。主要目标是对亚细胞结构、细胞或组织等同生命结构层次中所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化，并寻找在特定条件下蛋白质组所发生的变化，如表达量、翻译后修饰、亚细胞水平上定位等。

（2）结构蛋白质组学是指对上述全部蛋白质精确三维结构的测定，以及对其结构与功能关系的分析。

（3）功能蛋白质组学：通过分离蛋白质复合物系统地研究蛋白质间的相互作用，以建立细胞内信号转导通路的复杂网络图。通过分析单个蛋白质是否与有抑制功能的蛋白质相互作用可得到揭示其功能的线索，通过免疫沉淀或蛋白质亲和纯化的方法对可以鉴定与某种感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质，通过蛋白质芯片或酵母双杂交系统可以进行蛋白质相互作用的体外或体内检测。 11、蛋白质样品制备过程中应着重注意哪几方面？

（1）应保持蛋白质的最大溶解度和可重复性；（2）选择合适的表面活性剂和还原剂； （3）去除干扰分子和污染；（4）防止蛋白质在处理过程中的修饰，使用低温条件制备； （5）裂解液应新鲜制备；（6）样品应保持新鲜 ;

17、Anfinsen原理：决定一个蛋白质分子高级结构的全部信息都包含于一级结构即多肽链的氨基酸序列中，蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构。

18、蛋白质的二级结构是指一段连续的肽单位借助于氢键，排列成的具有周期性结构的构象。蛋白质中主要的二级结构包括α—螺旋、β—折叠、回折、环肽链、无规则卷曲等。

19、参与蛋白质与DNA分子间相互作用的结构域有：螺旋-转角-螺旋，锌指结构，亮氨酸拉链，螺旋-环-螺旋结构，SPXX序列等。

20、分子伴侣：一类相互之间有关系的蛋白，它们的功能是帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价键的组装，并且不是组装完成的结构在发挥其正常的生物功能时的组成部分。也就是说，分子伴侣可介导蛋白质的正确的折叠与装配，但并不构成被介导的蛋白质组分。

21、蛋白质胶上酶解后，可以通过肽质量指纹图(peptidemassfingerprinting，PMF)进行鉴定。蛋白质酶切的目的是尽可能多地获得合适长度的肽片段以供质谱分析。一般而言，含有6-20个氨基酸残基的肽片段适合MS分析和数据库比较。

22、蛋白质裂解液的成分：变性剂，表面活性剂，还原剂，载体两性电解质，蛋白酶抑制剂。 27、生物质谱仪的关键性能指标：灵敏度，分辨率，质量精确性。

28、影响ESI样品离子信号的主要因素有：样品溶液的pH值；溶剂的性质和去溶剂时干燥气体的温度与流速。 29、蛋白质翻译后修饰：蛋白质是基因功能的执行者，很多蛋白质在翻译中或翻译后都要经历一个共价加工的过程，即通过在1个或几个氨基酸残基上加上修饰基团或通过蛋白质水解剪切去基团而改变蛋白质的性质。这种过程称为蛋白质翻译后修饰。

蛋白质的磷酸化修饰和糖基化修饰是在真核生物中广泛存在并且研究较多的两种修饰形式。

获得糖基化蛋白的方法主要是电泳法和色谱法，富集分离糖蛋白的技术主要有凝集素亲和技术、肼化学富集法等，生物质谱技术也是糖基化氨基酸位点鉴定的主要技术手段。

磷酸化蛋白质的检测方法：放射性标记技术，免疫印迹技术，荧光染料染色技术，质谱技术。 富集磷酸化蛋白质的主要手段是通过磷酸化蛋白质的抗体免疫沉淀，也可采用化学修饰的方法。

磷酸化蛋白质或肽段上的磷酸基团用另一种亲和配基取代，以亲和层析的方法从混合物中分离富集磷蛋白或磷酸肽。主要有2种取代方式，一种是β消除法，另一种是碳二亚胺缩合法。β消除法适合于磷酸化丝氨酸和苏氨酸的取代。在β消除之前要先对肽段混合物用蚁酸处理将其氧化。

碳二亚胺缩合法是通过碳二酰乙胺浓缩反应，最终在磷酸基团上连接一个半胱胺基团，修饰的磷酸肽用固相化的碘乙酰凝胶亲和提取，最后使用三氟醋酸洗脱来富集磷酸化肽段。这种方法适合于各种磷酸氨基酸的取代。 DIGE的蛋白标记常采用2种方法，一种为最小标记法，一种为饱和标记法。 蛋白质空间结构的实验测定方法主要有2种：X射线衍射法和核磁共振(NMR)技术。 X射线衍射法的特点：

1、X射线的波长（0.05-0.15nm）适合用于测量原子间距，适于分析侧链。

2、测定蛋白质结构最精确的方法之一。目前已知蛋白质结构中的80％是通过这种技术获得的。 3、样品先结晶，晶体将x光衍射到探测装置从而获得衍射图像，对其推导进而获得蛋白质结构图。

X射线晶体衍射技术优点：测定结果可靠，速度快，不受样品大小，无论多大的蛋白，或者复合体，（蛋白质，RNA,DNA,小分子等），只要能够结晶就能够得到其原子结构。缺点是必须进行结晶，很多蛋白质很难结晶；晶体中的蛋白质分子构象是静态的，无法测定不稳定的过渡态的构象。

NMR的优点：能研究溶液中的蛋白质结构，能提供大量有关动态的信息，测定结果与X射线技术非常接近，缺点是只能测定较小的蛋白质结构，很难获得蛋白质分子完整的三维结构。

PDB数据库中的蛋白质结构的记录信息，是以文本的形式存放，为了更加直观地观察蛋白质的三维结构，已开发出许多的分子结构显示程序，其中的典型代表是PyMol程序。

蛋白质结构分类的主要方案是采用分层次的分类方法。目前，代表性的结构分类数据库有SCOP和CATH。 在SCOP数据库中，蛋白质结构被分为类型、折叠、超家族和家族4个层次。 在蛋白质结构与功能的关系中，存在以下2种进化关系：

蛋白质通过其特定的三维结构行使其生物学功能，蛋白质结构决定其功能。1、趋同进化：序列和结构均不同，但通过进化，产生了相似的功能位点结构，从而具有了相似的功能的蛋白质。2、趋异进化：具有不同的生物化学功能，却具有非常相似的三维结构及足以暗示同源性的序列一致性。

二级结构预测的基本原理就是通过对结构已经测定的蛋白质序列和其二级结构对应关系的统计分析，归纳出一些预测规则，用于待测蛋白质的二级结构预测。

二级结构预测的目标是判断每一个氨基酸残基是否处于α螺旋、β折叠、转角（或其它状态）之一的二级结构态，即三态。

二级结构预测方法大致分为3代，第一代是基于单个氨基酸残基统计分析，代表性方法有Chou-Fasman方法；第二代是基于氨基酸片段的统计分析，代表性的方法有GOR方法；第三代方法主要采取的策略有：机器学习方法的使用和序列进化信息的考虑。对于二级结构三态预测准确率首先达到70%的方法是基于统计的神经网络方法PHDsec。

蛋白质三级结构预测方法，主要可分为3类：同源模拟、折叠识别和从头计算方法。

同源模拟一般可分为以下几个步骤：①模板的选择；②待测序列与模板的序列比对；③同源模型的建立；④同源模型的评估。

折叠识别一般可以分为4个步骤进行：建立蛋白质结构模板数据库；设计合适的打分函数来衡量查询序列与模板数据库中结构的相似性；对打分函数得到的结果进行统计显著性分析；对结构模板数据库中计算得到具有统计显著性的蛋白质结构排序。

折叠识别按其发展过程可以分为两代方法：第一代穿针引线法，其最经典的两个策略有：①分子平均势能函数的使用；②考虑不同氨基酸倾向于出现在不同结构环境中。第二代折叠识别算法。

生物体内的蛋白质-蛋白质相互作用主要以3种形式存在：一是形成多亚基蛋白质的四级结构。二是形成蛋白质复合体。三是瞬时的蛋白质-蛋白质相互作用。

亲和层析(affinity chromatography)是利用待分离物质与其特异性配体间具有特异性的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。即发生相互作用的蛋白质分子之间存在这种特异性的亲和力。 SPR常用表面基质是羧甲基葡聚糖。SPR表面基质主要有四个作用： (1)共价固定生物分子，使不同芯片可用来检测不同物质。 (2)可通过增加表面固定生物分子的结合力而提高芯片的灵敏度。 (3)为大多数生物反应提供亲水环境。 (4)使表面的非特异性结合强度降低。

反向酵母双杂交系统：该系统采取反向选择筛选的方法，关键是引入一种对细胞生长有毒的报道基因，用于监测蛋白间的相互作用。常用的报告基因有3种即URA3，CYH2和LYS2。当野生型BD-X与AD-Y间发生相互作用时，启动了毒性报告基因的表达，它对酵母菌株有毒性或者是致死的。当二者解离时毒性报告基因不能表达，菌株具有生长优势。不同的毒性报告基因都可用来提供阴性筛选。

免疫共沉淀原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。

Pull down 实验原理：利用GST、HIS等标签蛋白将一种蛋白质（诱饵蛋白）固定于某种基质上(如Sepharose)，当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，通过改变洗脱液或洗脱条件即可回收所吸附的蛋白。

WB的基本步骤：

1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)

2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 (2) 样品处理(3) 上样与电泳 3. 转膜(Transfer) 4. 封闭(Blocking)

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 7. 蛋白检测(Detection of proteins) 8. 膜的重复利用(Membrane recovery)

检索SWISS-PROT数据库有3种方式：序列比对方式(BLAST)、蛋白质名称、数据库记录号(accession number)。 蛋白质功能信息学数据库包括基因数据库(GENES database)、通路数据库(PATHWAY database)、配体化学反应数据库(NGAND database)、序列相似性数据库(SSDB)、基因表达数据库(EXPRESSION)、蛋白质分子相互关系数据库(BRITE)以及相关疾病(KEGGDISEASE)和药物数据库(KEGGDRUG)。

蛋白质序列的相似性和同源性是两个不同的概念。相似性(similarity)是量上的描述，即两个序列的相同或相似的程度。比如，A序列和B序列的相似性是80％。衡量相似性常用的程序有CLUSTAL等。同源性(homologY)指从一些数据中推断出两个蛋白质序列是否有共同祖先的结论。对同源性的判断只有“是”或“不是”两种可能。比较同源性常用的程序有BLAST、FASTA等。序列间的相似性越高，同源序列的可能性就大，通过序列的相似性可以推测序列是否同源。

蛋白质组信息学的应用主要包括：序列比对、结构预测和药物设计。

请以Molsoft ICM软件为例来说明基于靶点蛋白质Hsp90的药物筛选。 Hsp90是抗肿瘤药物的作用靶点之一，其抑制剂已成为重要的抗肿瘤药物先导化合物。如果要从化合物库中进行Hsp90抑制剂的筛选，则可以按以下步骤进行： 第一步，进行蛋白质结构的准备，Hsp90的晶体结构可从相应的蛋白质数据库中下载,打开相应的pdb文件，进行结构转换与调整，加氢、能量最小化、去掉原有配体，再以Icm pocket finder程序自动生成pocket。 第二步，蛋白质结构准备好后，生成拟筛选的小分子化合物的结构并进行编辑，如结构转换、单双键的确定及能量最小化等步骤准备好小分子。 第三步，进行分子对接，运用ICM的Docking程序进行。对接结果以能量、RMSD值。等内容显示，一般是根据能量大小进行排队：另外可与Hsp90的已知抑制剂geldanamycin(GA)进行比较。由于免费的ICM一般不具备不具备VLS的功能，只能一个化合物一个化合物对接，根据与GA的比较结果，确定哪个化合物的能量最低且RMSD最小，再综合结构互补等因素，从众多的化合物中筛选出可能的抑制剂。然后将筛选出的化合物与结合分子或细胞水平的实验进行验证。

高丰度蛋白去除技术有哪两种基本方法，请简述其原理：

（抗体亲和法：通过抗原抗体反应原理，用针对样品中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除样品中的高丰度蛋白；染料亲和法：通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除样品中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。）

现有四种蛋白质，其相对分子质量和等电点分别为：A,Mr=62kDa，pI=10；B,Mr=12kDa，pI=7；C,Mr=28kDa，pI=4；D,Mr=9kDa，pI=5，分别用CM-纤维柱层析，Sephadex G-75，双向电泳，SDS-PAGE电泳分离这四种蛋白质，试写出前两种方法的分离结果和后两种方法的分离图谱。（北京大学2010试题）

• 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交

换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素―O―C6H14 N+ H，它的反离子为阴离子（如Cl- 等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2 －COO－），其反离子为阳离子（如Na+ 等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 • 答：（1）四种蛋白质与CM-纤维素离子交换剂的结合力大小为：A＞B＞D＞C，经过洗脱液洗脱出来的顺

序是C、D、B、A。 • （2）Sephadex是以葡聚糖凝胶为介质的凝胶过滤。经过洗脱分子量大的先洗脱出来，分子量小的后洗脱

出来。所以这四种蛋白质的洗脱顺序为A、C、B、D。 • （3）SDS-PAGE与双向电泳的分离图谱为：

萎缩：指发育正常的实质细胞，组织或器官的体积缩小。 肥大：实质细胞体积增大引起组织和器官的体积增大。 增生：器官或组织的实质细胞增多。

化生：一种分化成熟的细胞类型受刺激因素的作用转化为另一种分化成熟的细胞类型的过程。

肉芽组织：指新生的毛细血管及成纤维细胞构成的幼稚结缔组织，并伴有炎性细胞浸润。 淤血：组织或器官由于局部静脉回流受阻，血液淤积与小静脉和毛细血管内，呈静脉性充血，又称被动性充血。 梗死：局部组织、器官由于血流迅速中断而引起的缺血性坏死。

坏疽：指继发菌感染的较大范围组织坏死 炎症：具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的以防御为主的反应。 肿瘤: 机体在各种致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长和分化的正常，导致克隆性异常增生而形成的新生物，常表现为局部肿块。 心衰细胞：吞噬有含铁血黄素颗粒的巨噬细胞。

风湿小体：在心肌间质的小血管附近，风湿细胞围绕着纤维素样坏死灶聚集，外围有少量淋巴细胞浸润，形成圆形或梭形境界清楚的结节状并灶。

良性肿瘤与恶性肿瘤的区别

分化程度 核象 生长速度 生长方式 继发改变 转移 复发 对机体的影响 良性肿瘤 分化好，异型性小，与起源组织形态相似 无或少，不见病理性核象 缓慢 膨胀性或外生性生长，常有包膜，与周围组织分界清楚 一般较少见 不转移 不复发或很少复发 较小，主要为局部压迫或阻塞 恶性肿瘤 分化低，异型性大，与起源组织形态差异大 多见，可见病理性核象 较快 浸润性或外生性生长，无包膜，与周围组织分界不清 常发生出血，坏死，溃疡，感染等 常有转移 手术等治疗后易复发 严重，除压迫，阻塞外还可破坏组织，引起出血，坏死，感染，恶病质等，甚至导致患者死亡 肉瘤 间叶组织 较低，多见于青少年 灰红色，质软，湿润，细腻，鱼肉状 肉瘤细胞多弥漫分布，实质与间质分界不清楚，间质内血管丰富，纤维组织少 肉瘤细胞间多有网状纤维 多经血道转移 表达间叶组织标记 癌和肉瘤的区别

组织来源 发病率 肉眼特点 组织学特点 网状纤维 转移 免疫组化 癌 上皮组织 较高，约为肉瘤的9倍，多见于40岁以后成人 灰白色，质硬，粗糙，干燥 癌细胞多成巢，实质与间质分界清楚 癌巢周围有网状纤维，癌细胞间无网状纤维 多经淋巴道转移 表达上皮组织标记