大豆卵磷脂DNA的提取方法及应用

韩建勋;吴亚君;王斌;杨海荣;陈颖

【摘 要】The difficulty of detecting genetically modified products lies in DNA extraction from deep-processing products. In this study, DNA from soybean lecithin which was chose as the research object, was extracted and puri- fied by CTAB method, bead kit and NucleoSpin Food kit. The purified DNA was detected by real- time PCR using soybean lectin gene which was one of soybean endogenous genes. The detecting result showed that CTAB method was suitable for DNA extraction of soybean lecithin. By optimizing the conditions of CTAB method, improved II method was determined as the best DNA extraction method for soy lecithin. And DNA extracted by improved II method has high purity. The results of further testing of genetically modified ingredients confirmed that several commercial products were non-GMO.%以大豆卵磷脂为研究对象，比较了CTAB法、磁珠试剂盒法以及硅胶膜试剂盒法等3种DNA提取纯化方法。通过大豆内源基因Lectin实时荧光PCR检测，发现CTAB法提取的大豆卵磷脂DNA质量优于其它两种方法，并以CTAB法为基础进行条件优化，进一步提高DNA纯度。采用该方法对6个不同品牌的市售大豆卵磷脂产品进行转基因成分（CAMV35S启动子及NOS终止子）检测，结果证实均不含转基因成分。 【期刊名称】《食品与发酵工业》 【年(卷),期】2011(037)009 【总页数】6页(P185-190)

【关键词】大豆卵磷脂;DNA提取;实时荧光PCR 【作 者】韩建勋;吴亚君;王斌;杨海荣;陈颖

【作者单位】中国检验检疫科学研究院,北京100123;中国检验检疫科学研究院,北京100123;中国检验检疫科学研究院,北京100123;中国检验检疫科学研究院,北京100123;中国检验检疫科学研究院,北京100123 【正文语种】中 文 【中图分类】TS207.3

大豆卵磷脂(soybean lecithin，又称大豆蛋黄素)，是精制大豆油过程中的副产品。大豆卵磷脂中含有卵磷脂、脑磷脂、心磷脂等，具有延缓衰老、预防心脑血管疾病等作用。根据我国的转基因食品标识管理规定，当大豆卵磷脂原料来自转基因大豆时，需要进行转基因标识。深加工食品的检测中，DNA的提取是难点之一［1－2］。由于深度加工使原料DNA在加工过程中遭到严重破坏，加工中出现的某些物理、化学变化或酶因子变化也会影响DNA质量［3］，因此，如何从深加工食品中提取高质量的DNA，成为转基因食品检测成功与否的关键所在。

深加工食品DNA的提取方法包括经典的CTAB法、SDS法以及试剂盒方法，常用的试剂盒如Promega、Sigma、Invitrogen、TaKaRa 、Whatman 等。近年来国内外许多研究者针对不同种类的加工食品和不同的方法进行了比较。例如陈文炳［4］等利用异丙醇浓缩提取法从贝奇野菜汁、统一鲜橙多与超浓缩橙汁提取DNA。沈夏艳［5］等比较了简易法、试剂盒法以及改良试剂盒法，发现改良试剂盒法提取的苹果汁DNA质量较高，可用于RAPD技术分析。韩建勋［6］等采用多种CTAB法和磁珠试剂盒法提取果汁DNA，并对DNA的纯度、浓度及PCR扩增情况进行比较。白立群［7］等建立了大豆油的冷冻干燥－丙烯酰胺DNA提取

法。黄昆仑［9］等利用LH-Smart DNA试剂盒提取大豆原料及其产品DNA，用巢式和半巢式PCR进行检测，可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因。张明辉［10］等利用三重巢式PCR对大豆深加工产品(卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆粗油、大豆精炼油和大豆色拉油)进行定性检测，发现可扩增出除大豆精炼油和色拉油以外的所有深加工产品的内源基因Lectin、35S-CTP和EPSPS-NOS基因，其检测灵敏度达到0.005%。敖金霞［11］等发现利用五重巢式PCR可对商品化的转基因大豆、水稻、玉米深加工产品进行定性检测。Angela等［12］发现Wizard Magnetic方法对蔬菜食品提取效率更高，DNeasy对复合食品及加工食品提取效率更高。Isabel Mafra等［13］以大豆、豆粉、豆汁、酱油、大豆分离蛋白、豆腐、大豆甜点、含大豆的蔬菜食品等为样品，比较NucleoSpin试剂盒、GeneSpin试剂盒，CTAB法和Wizard方法，发现对于豆粉、大豆分离蛋白、豆腐，NucleoSpin、GeneSpin试剂盒方法最好，Wizard方法其次，均优于CTAB法，对于大豆饮品、甜点和含大豆的素食，CTAB法和Wizard方法提取效果较好。

大豆卵磷脂是一种重要的大豆深加工食品，随着功能性食品越来越受到消费者关注，相关的质量安全监管工作越来越重要。目前有关大豆卵磷脂转基因检测的报道还不多，随着技术的发展，对检测方法的指标提出更高要求，因此十分有必要对该类产品进行转基因成分检测方法研究，而首要任务是建立有效的DNA提取方法。本文以大豆卵磷脂作为研究对象，对CTAB法、磁珠试剂盒法以及硅胶膜试剂盒法等进行比较和优化，建立了适用于大豆卵磷脂的DNA提取方法。 1.1 材料 1.1.1 样品

健百特牌大豆卵磷脂软胶囊、自然之宝牌大豆卵磷脂软胶囊、瑞莱牌大豆卵磷脂软

胶囊、渔夫堡牌大豆卵磷脂软胶囊、奈氏力斯牌大豆卵磷脂软胶囊、奥诺康牌大豆卵磷脂软胶囊，以上试验样品均购自北京超市。 1.1.2 PCR扩增引物及探针 1.1.3 试剂及仪器

三氯甲烷、异丙醇购于北京六合通公司;2×CTAB 裂解液(40 g/L CTAB，2.8 mol/L NaCl，0.2 mol/L Tris、0.04 mol/L Na2-EDTA)、CTAB 沉淀液(5 g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl)、提取缓冲液(100 mL 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 6.4 、8.8 mL 0.5 mol/L EDTA，pH 8.0、2.6 g Triton ×100、120 g 异硫氰酸胍、13.2 mL ddH2O)、1.2 mol/L NaCl均为本实验自行配制;糖原(glycogen)购自Sigma公司、Fast Start Universal Probe MasterMix(Rox)购于罗氏公司、磁珠试剂盒购自Promega公司、NucleoSpin Food试剂盒购自北京北方仪涛商贸有限公司。

微量移液器(10 μL、100 μL、1000 μL)，德国 Eppendorf公司;电热鼓风干燥箱(DGX-9053-B1)，上海福玛实验设备有限公司;离心机(5804R型)，德国

Eppendorf公司;核酸蛋白分析仪(DU0，Beckman)，ABI 7700 real-time PCR System，Applied Biosystems，USA。 1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法比较 1.2.1.1 CTAB法

取1粒软胶囊中的卵磷脂至一洁净2.0 mL离心管中，共8组(即取8粒软胶囊)，分别加入1 mL无菌水，室温条件下振荡混匀1 h，16 000 g 10 min，取下层水相800 μL至一洁净2.0 mL离心管，加入800 μL 2×CTAB裂解液，于65℃烘箱中裂解1 h，期间混匀几次。加入400 μL氯仿，振荡混匀30 s，16000 g 10 min，分别取上清液650 μL至2只洁净2.0 mL离心管中，加入2倍体积(1 300

μL)CTAB沉淀液，混匀后于室温沉淀1 h，16 000 g 10 min，弃上清液，加入350 μL 1.2 mol/L NaCl 充分溶解后，再加入 350 μL氯仿，振荡混匀30 s，16 000 g 10 min，取上清液1200 μL至一洁净2.0 mL离心管中(8组样品合并成4管)，加入800 μL 异丙醇，混匀后室温沉淀 1 h，16 000 g 15 min，弃上清液，加入500 μL 70%乙醇，同时将2管合并为一管，混匀，16 000 g 15 min，弃上清液，沉淀自然晾干，各加入50 μL ddH2O溶解，两管合并共100 μLDNA溶液，4℃保存备用。 1.2.1.2 磁珠试剂盒法

取8粒软胶囊中的卵磷脂至一洁净的50 mL离心管中，加入4 mL A液、2 mL B液，于摇床(XHZ-3 SHAKER)300 r/min，20 min，加入 5 mL Precipitation Solution，剧烈振荡 30 s，8000 g 15 min，去除上层油相，小心将下层水相约5.5 mL转移至一洁净的50 mL离心管中，加入200 μL磁粉及0.9倍体积(4.95 mL)异丙醇，室温静置1 h，期间不断混匀，上磁力架，去除水相后加入1 mL 70%乙醇，振荡混匀30 s，上磁力架，去除液相，加入500 μL 70%乙醇，振荡混匀30 s，上磁力架，去除液相，于65℃烘箱中烘干，加入200 μL ddH2O 溶解，65 ℃ 孵育 10 min，间期不断混匀，上磁力架，转移水相至一洁净的1.5 mL离心管中，加入50 μL磁粉及0.8倍体积异丙醇，静置10 min，间期不断混匀，上磁力架，去除液相后加入500 μL 70%乙醇，振荡混匀30s，上磁力架，去除液相，于65℃烘箱中烘干，加入120 μL ddH2O溶解，65℃孵育10 min，间期不断混匀，上磁力架，转移水相约100 μL至一洁净的1.5 mL离心管中，4℃保存备用。 1.2.1.3 NucleoSpin Food试剂盒法

取1粒软胶囊中的卵磷脂至一洁净2.0 mL离心管中，共8组(即取8粒软胶囊)，分别加入1 mL无菌水，室温条件下振荡混匀1 h，16 000 g 10 min，取下层水相800 μL至一洁净2.0 mL离心管，加入550 μL CF、10 μL Proteinase K，65 ℃

30 min;10 000 g 10 min;将上清液平均分配至2只2.0 mL洁净离心管中，分别加入1倍体积C4、1倍体积乙醇，共计16只离心管，将所有上清液集中至50 mL离心管中，后续步骤参照试剂盒说明书要求进行，最后用100 μL灭菌水洗脱DNA，4℃保存备用。 1.2.2 DNA提取方法改良

以CTAB为基础，对其裂解条件及DNA沉淀方式分别作如下改良。 1.2.2.1 改良Ⅰ

取1粒软胶囊中的卵磷脂至一洁净2.0 mL离心管中，共8组(即取8粒软胶囊)，分别加入1 mL无菌水，室温条件下振荡混匀1 h，16 000 g 10 min，取下层水相约600 μL至一洁净2.0 mL离心管，加入等体积2×CTAB裂解液及5 μL蛋白酶K，于65℃烘箱中裂解1 h，期间混匀几次。将每管液体分成两管加入0.7倍体积氯仿，振荡混匀30 s，16 000 g 10 min，分别取上清液500 μL至洁净1.5 mL离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇400 μL及1 μL糖原，混匀后室温沉淀 1 h，16 000 g 15 min，弃上清液，加入 500 μL 70%乙醇混匀，16 000 g 15 min，弃上清液，沉淀自然晾干，加入100 μL ddH2O依次溶解16管DNA，4℃保存备用。 1.2.2.2 改良Ⅱ

改良Ⅱ方法是在改良Ⅰ方法的基础上将2×CTAB裂解液换成提取缓冲液，其它实验操作步骤不变。 1.2.2.3 改良Ⅲ

取8粒软胶囊中的卵磷脂至一洁净50 mL离心管中，分别加入8 mL无菌水，室温条件下振荡混匀1 h，10 000 g 10 min，取下层水相5.5 mL(尽可能多取)至一洁净50 mL离心管，加入等体积2×CTAB裂解液及10 μL蛋白酶K，于65℃烘箱中裂解:1h，期间混匀几次。加入7.7 mL氯仿，振荡混匀30 s，10 000 g 10

min，分别取上清液4 mL至一只洁净50 mL离心管中，加入150 μL磁粉及0.8倍体积异丙醇，室温静置1 h，期间不断混匀，上磁力架，去除水相后加入1 mL 70%乙醇转移至1.5 mL离心管中，振荡混匀30 s，上磁力架，去除液相，于65℃烘箱中烘干，加入100 μL ddH2O 溶解。 1.2.2.4 改良Ⅳ

在改良Ⅲ方法的基础上将2×CTAB裂解液换成提取缓冲液，其它实验操作步骤不变。

1.2.2.5 改良Ⅴ

改良Ⅴ方法是在改良Ⅲ的基础上将试剂盒磁粉换成自制磁粉，其它实验步骤不变。 1.2.2.6 改良Ⅵ

改良Ⅵ方法是将改良Ⅳ方法中的试剂盒磁粉换成自制磁粉，其它实验步骤不变。 1.2.3 DNA纯度分析

为判断最佳改良方法提取的大豆卵磷脂DNA的纯度，看是否含有对荧光PCR反应的DNA抑制剂，将其DNA母液进行5倍稀释，4个梯度，分别为5倍稀释液、52倍稀释液、53倍稀释液、54倍稀释液，然后进行大豆内源Lectin扩增，并将其扩增Ct值与稀释倍数进行数据分析。 1.2.4 实时荧光PCR反应体系及程序

实时荧光PCR采用25 μL的总体系:Fast Start Universal Probe

Master(Rox)12.5 μL;上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL;探针(10 μmol/L)0.5 μL;DNA 模板5 μL，用无菌水补至总体系为25 μL。PCR扩增反应及结果分析在ABI7700实时荧光PCR仪上进行。反应程序为:95℃ 预变性10 min;95℃ 15s，60℃ 60 s，共运行50个循环。 1.2.5 市售卵磷脂制品转基因成分检测

采用优化的方法提取6种市售大豆卵磷脂制品DNA。利用实时荧光PCR方法对6

种样品进行转基因成分检测，扩增的基因包括Lectin基因、CaMV35S启动子、NOS终止子，扩增体系和程序同1.2.4。同时设立阳性对照(大豆DNA作为Lectin基因阳性对照、转基因水稻DNA作为外源CaMV35S启动子、NOS终止子的阳性对照)和空白对照(无菌双蒸水)。 2.1 DNA提取方法结果比较

分别用CTAB法、磁珠试剂盒法法、NucleoSpin Food试剂盒法对健百特牌大豆卵磷脂软胶囊进行DNA提取，并进行大豆内源Lectin基因扩增，扩增曲线如图1所示。结果表明:3种方法提取的大豆卵磷脂DNA荧光PCR均有扩增，但是扩增结果不同。其中CTAB法提取的大豆卵磷脂DNA质量最好，10管平行反应均出现荧光扩增曲线，且Ct均值为33.28;磁珠试剂盒法提取的DNA质量较差，6管平行反应出现荧光扩增曲线，其余4管反应曲线在基线位置;NucleoSpin Food试剂盒法DNA提取质量最不理想，仅有5管平行反应出现荧光扩增曲线，且Ct均值低于其它2种方法。实验结果表明，较磁珠试剂盒法及NucleoSpin Food试剂盒法，CTAB法在提取大豆卵磷脂DNA质量方面具有明显优势。 2.2 DNA提取方法改良结果比较

2.1中得知CTAB法在提取大豆卵磷脂DNA质量方面要优于磁珠试剂盒法及NucleoSpin Food试剂盒法，因此本实验在CTAB法基础上进一步对其实验步骤做了不同程度的优化，方法分别为:改良Ⅰ、改良Ⅱ、改良Ⅲ、改良Ⅳ、改良Ⅴ及改良Ⅵ。利用6种改良方法提取大豆卵磷脂软胶囊(健百特牌)DNA，按照1.2.3对Lectin基因进行实时荧光PCR扩增，各10个平行，其扩增结果与CTAB法比较，以确定最佳的改良方法。

就Ct值而言，CTAB法、改良Ⅰ、改良Ⅱ、改良Ⅲ、改良Ⅳ、改良Ⅴ及改良Ⅵ扩增结果Ct值分别为33.28、41.62、32.73、50、50、48.06 及 50，即:改良Ⅱ＜CTAB法＜改良Ⅰ＜改良Ⅴ＜改良Ⅲ=改良Ⅳ=良Ⅵ(图2);从阳性检出概率方面考

虑，7种方法的检测概率分别为100%、70%、100%、0、0、20%及 0，CTAB法与改良Ⅱ的检测概率相同，均为100%，好于其它5种方法。综合比较，改良Ⅱ方法提取的大豆卵磷脂DNA质量最佳，优于其它方法。 2.3 DNA纯度结果分析

将改良Ⅱ方法提取的大豆卵磷脂DNA进行5倍稀释，4个梯度，分别为:5倍稀释液、52倍稀释液、53倍稀释液、54倍稀释液，然后进行大豆内源Lectin扩增(图3)，并将其Ct值与lg(n)数据处理，获得之间的线性关系(图3)，n为DNA稀释倍数。根据Ct值与lg(n)的线性公式:y=4.369 3x+34.056，可推知:当x=0时，y=34.056，即大豆卵磷脂DNA母液的Ct值为34.056，与荧光PCR检测Ct值33.96比较，其△Ct=0.096 ＜0.5［14］，说明改良Ⅱ方法提取的大豆卵磷脂DNA溶液中不含有抑制剂，见图3。因此选择该方法作为大豆卵磷脂的提取方法。 2.4 市售卵磷脂制品检测结果

利用建立的方法提取6种市售大豆卵磷脂胶囊样品中DNA成分，并对其大豆内源基因Lectin、外源基因CAMV35S启动子及NOS终止子进行实时荧光PCR扩增，扩增结果见表4。结果表明:6种大豆卵磷脂胶囊样品可检出大豆Lectin内源基因，均未检出外源基因CAMV35S启动子及NOS终止子。说明6种市售样品均含大豆成分，且为非转基因大豆成分。

大豆卵磷脂作为大豆深加工产品，经过醇醚溶液浸提、丙酮等溶剂萃取的诸多工艺后，严重了破坏大豆基因组的完整性，导致很难提取到浓度高、纯度好的DNA，因此制约了对大豆卵磷脂中转基因成分的检测。

目前，针对大豆卵磷脂DNA提取方面的报道在国内较少。本研究以大豆卵磷脂软胶囊为研究对象，首先比较了CTAB法与商用试剂盒，包括磁珠吸附式及过柱吸附式两种，实验发现，3种方法均可从大豆卵磷脂中提取到DNA，但是CTAB法提取效果强于商用试剂盒，其DNA Lectin基因检测Ct值低，且10管平行反应

中阳性检出率高。CTAB方法优于试剂盒方法的原因可能是大豆卵磷脂经过加工后，一方面大豆DNA受到严重破坏，形成碱基数很小的片段，另一方面卵磷脂中大豆DNA成分含量较低，而磁珠吸附与过柱吸附两种商用试剂盒在DNA提取过程中虽然可很好地吸附 DNA，去除杂质，纯度较好，但是DNA损失却很大，导致DNA浓度过低，Lectin基因检测阳性检出率不高。

CTAB法提取DNA质量较好，价格便宜，但提取过程较复杂，提取时间较长。基于此，本实验对CTAB法进行了6次优化，以期达到不仅可提取到高质量的DNA，而且实验操作简单、省时的目的。糖原(glycogen)作为DNA或RNA的辅助沉淀剂，大多数情况下糖原比tRNA或超声处理过的DNA效果更好，由于糖原中不含DNA和RNA，因此用糖原作为辅助沉淀剂沉淀下来的核酸更适合于后续的PCR、RT-PCR以及内切酶等核酸酶反应。本实验尝试省略了CTAB法中CTAB沉淀DNA、1.2 mol/L NaCl溶解DNA及其后的氯仿变性蛋白质步骤，比较了CTAB裂解液与提取缓冲液对组织细胞的裂解效果、糖原结合异丙醇与试剂盒磁粉及自制磁粉沉淀DNA的效果，实验中发现提取缓冲液与糖原结合异丙醇组合可以更好地提取高质量的大豆卵磷脂DNA，Lectin基因检测Ct值更低，可达32左右，100%阳性检测，根据Ct值与lg(n)的线性关系得到的Ct值与荧光PCR检测Ct值相当，DNA溶液纯度较好，而且实验步骤简单易行、省时省力。利用优化的方法对6种市售样品进行检测，Lectin基因全部检出，而外源基因均未检出，说明该方法可用于实际样品转基因成分检测。

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