荧光寿命测定的现代方法与应用

荧光寿命测定的现代方法与应用

房 喻 王 辉

(陕西师范大学化学系 西安 710062)

摘 要 介绍了时间相关单光子计数、相调制和频闪等三种现代荧光寿命测定方法的工作原理,指出了各种方法的优点和局限性;介绍了时间相关单光子计数实验数据的处理方法;概述了时间分辨荧光技术在化学和生命科学中的应用。

关键词 荧光寿命 单光子计数 相调制法 频闪技术

Abstract Theprinciplesandcharacteristicsofsomeofthemoderntechniques,includingtime2correlatedsingle2photoncounting(TCSPC),phasemodulationandstrobetechniques,forfluorescencelifetimemeasurementshavebeenbrieflyintroduced.Theadvantagesanddisadvantagesofeachmethodhavealsobeenpointedout.Thecommonmethodusedfortheanalysisofthefluorescencedecay,takingTCSPCasanexample,hasbeendiscussedindetail.Onthebasisoftheseintroductions,theapplicationsoftime2resolvedfluorescencetechniquesinchemicalandbiologicalre2searchhavebeenoverviewed.

Keywords Fluorescencelifetime,Time2correlatedsinglephotoncounting,Phasemodulationmethods,Strobetechniques

荧光是分子吸收能量后其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的,而荧光寿命是指分子在单线激发态所平均停留的时间。荧光物质的荧光寿命不仅与自身的结构而且与其所处微环境的极性、粘度等条件有关,因此通过荧光寿命测定可以直接了解所研究体系发生的变化。荧光现象多发生在纳秒级,这正好是分子运动所发生的时间尺度,因此利用荧光技术可以/看0到许多复杂的分子间作用过程,例如超分子体系中分子间的簇集、固液界面上吸附态

[2][3]

高分子的构象重排、蛋白质高级结构的变化等。除了直接应用之外,荧光寿命测定还是其它时间分辨荧光技术的基础。例如基于荧光寿命测定的荧光猝灭技术可以研究猝灭剂与荧光标记物或探针相互靠近的难易,从而对所研究体系中探针或标记物所处微环境的性质作出判断。基于荧光寿命测定的时间分辨荧光光谱可以用来研究激发态发生的分子内或分子间作用以及作用发生的快慢。另外,非辐射能量转移、时间分辨荧光各向异性等主要荧光技术都离不开荧光寿命测定。因此本文拟对荧光寿命测定的主要方法、各种方法的原理、特点以及荧光寿命测定的主要应用进行介绍。

[1]

1 荧光寿命测定

荧光寿命测定的现代方法主要有三种,即时间相关单光子记数法(Time2CorrelatedSingle2PhotonCounting,TCSPC)、相调制法(PhaseModulationMethods)和频闪技术(StrobeTechniques)。在这些方法出现之前,人们也曾通过测定荧光物种在溶液中的荧光偏振(P)、溶液粘度(G)以及估算荧光物种

房 喻 男,44岁,博士,教授,主要从事光物理应用和高分子胶体与界面研究。E2mail:yfang@snnu.edu.cn国家自然科学基金资助项目(29973024)和教育部中青年骨干教师基金资助项目(3006)2001201231收稿,2001202225修回

#632#化学通报 2001年第10期 http:PPwww.chemistrymag.org

[4]

的分子体积(V0),根据Perrin方程来计算荧光寿命

1-P

[4,5]

,虽然这种方法所用仪器比较简单,但测定过

1+

RTSGV0

(1)

程烦琐,而且不管荧光衰减机理,都只给出平均寿命,因此实际应用意义有限。

1S3

1-P0

13111 时间相关单光子记数法

TCSPC是目前主要应用的荧光寿命测定技术,1975年由PTI(PhotonTechnologyInternational)公司首先商品化。此外,EdinburghInstruments、IBH、HORIBA等公司也在生产基于TCSPC的时间分辨荧光光谱仪。

TCSPC的工作原理如图1所示,光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号,该信号通过恒分信号甄别器1启动时辐转换器工作,时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号。另外,光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池,样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终止光电倍增管,由此产生的电信号经由恒分信号甄别器2到达时幅转换器并使其停止工作。这时时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多道分析仪(MultichannelAnalyzer)的相应时间通道计入一个信号,表明检测到寿命为该时间的一个光子。几十万次重复以后,不同的时间通道累积下来的光子数目不同。以光子数对时间作图可得到如图2所示直方图,此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。

图1 单光子计数(TCSPC)测定

荧光寿命工作原理图

图2 单光子计数荧光衰减曲线

形成示意图

实际测定中,必须调节样品的荧光强度,确保每次激发后最多只有一个荧光光子到达终止光电倍增管。假若一次激发引起的是多个荧光光子信号,则最先到达光电倍增管的(寿命短的)光子引起时幅转换器停止,而长寿命的光子不被检测,这样实际得到的荧光衰减曲线将向短寿命一方偏移,这种现象被称之为/堆积0效应(PileupEffect)。为了避免堆积效应,实际测定时,多道分析仪存储的光子数大致只有光源脉冲数的1%。也就是说,光源100次脉冲,大约只有1次所引发的荧光被检测。如果在预设时间内没有荧光信号到达终止光电倍增管,则时幅转换器自动回复到零,不输出信号。

TCSPC法的突出优点在于灵敏度高、测定结果准确、系统误差小,是目前最流行的荧光寿命测定方法。但是这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢,无法满足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。

[6,7]

http:PPchina.chemistrymag.org 化学通报 2001年第10期#633#

112 相调制技术

[8]

相调制技术也称之为/频域法0(Frequency2DomainMethod)。相调制与TCSPC不同之处在于样品被正弦调制的激发光激发,发射光是激发光的受迫响应,因此发射光和激发光有着相同的圆频率(X),但是由于激发态的微小时间停滞)))荧光寿命,调制发射波在相上滞后激发波一个相角<。另外,相对于激发波,发射波被部分解调,其振幅比激发波的振幅小。利用实验测定的相角<和解调参数m(发射波振幅与激发波振幅之比)可计算出相寿命(Sp)和调制寿命(Sm),对于单指数衰减,Sp与Sm相等。关于相调制法荧光寿命的测定原理可参见文献[4]。

相调制技术所用仪器比TCSPC类仪器便宜,而且测定速度也快得多,但实验所能选择的频率数有限,因此测量精度较差。1980年后多频相技术得到发展,相调制技术测定荧光寿命的精度也随之提高,从而使复杂体系荧光寿命测定成为可能。但同时仪器也变得昂贵,实验测定难度也相应增大。

[9]

113 频闪技术

频闪技术也叫脉冲取样技术(PulseSam2plingTechniques),仪器工作原理示于图3(a)。测定中,样品被脉冲光源激发。与脉冲光源同步,电压脉冲启动或按一定程式延迟启动光电倍增管,光电倍增管按预设时间门($t)检测样品的荧光强度。一般检测时间门比荧光寿命短得多,这样通过逐渐改变光电倍增管的延迟时间,可以得到样品被脉冲光源激发后不同时刻的一系列荧光强度,结果如图3(b)所示。实际上早在1960年就有人提出用频闪技术测定荧光寿命,不过当时能够测定的荧光寿命在毫秒级、分辨率太差,实用价值不大,因此一直没有得到广泛关注。随着计算机技术的发展,1987年PTI公司将纳秒级频率荧光寿命测定仪

[9]

商品化。最近PTI公司推出了新一代频闪分

[11]

时光谱仪,据称新一代频闪分时光谱仪有着TCSPC的准确性,比相调制测定速度更快,操作也很方便,仪器价格也大大降低。不过脉冲法得到的荧光衰减曲线包含噪音的水平尚无法知

图3 脉冲取样法测定荧光寿命工作原理图

(a)工作原理图;(b)检测时间门与

[10]

荧光衰减关系示意图道,在数据分析时应当有所估计。

[12]

除了上述三种主要的荧光寿命测定方法外,条纹相机法(StreakCameras)和上转换法(Upcon2

versionMethods)

[13]

近年来也颇受人们关注。

2 荧光寿命测定中的数据处理

211 荧光寿命及其含义

假定一个无限窄的脉冲光(D函数)激发n0个荧光分子到其激发态,处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为#和knr,则激发态衰减速率可表示为

dn(t)

=-(#+knr)n(t)dt(2)

其中n(t)表示时间t时激发态分子的数目,由此可得到激发态物种的单指数衰减方程。#634#化学通报 2001年第10期 http:PPwww.chemistrymag.orgn(t)=n0exp(-tPS)

(3)(4)

式中S为荧光寿命。荧光强度正比于衰减的激发态分子数,因此可将上式改写为:

I(t)=I0exp(-tPS)

其中I0是时间为零时的荧光强度。于是,荧光寿命定义为衰减总速率的倒数:

S=(#+knr)-1

(5)

也就是说荧光强度衰减到初始强度的1Pe时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿命。实际上用荧光强度的对数对时间作图,直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。荧光寿命也可以

理解为荧光物种在激发态的统计平均停留时间。事实上当荧光物质被激发后有些激发态分子立即返回基态,有的甚至可以延迟到5倍于荧光寿命时才返回基态,这样就形成了实验测定的荧光强度衰减曲线。

由于实际体系的复杂性,荧光衰减往往要用多指数或非指数衰减方程描述:

I(t)=

EAexp(-ii

tPSi)

(6)

式中Ai为第i项的指前因子。衰减方程的复杂性反映了体系中荧光物种的多样性或存在状态的复杂性。

212 荧光强度衰减曲线

考虑到实际工作中TCSPC用的最多,而且由其所得到的结果也最为可靠,因此仅以TCSPC实验结果说明实际荧光衰减曲线及其分析方法。图4给出用TCSPC法测得的闪烁体(Scintil2lator)2,52二苯基21,3,42二唑(2,52diphenyl21,3,

[6]

42oxadiazole,PPD)的荧光强度衰减曲线。图中有三条曲线,分别是实际测定强度衰减曲线N(tk)、仪器响应函数L(tk)和拟合函数Nc(tk)。注意,函数都是对离散变量tk而言,这是由于实际测定中,将检测到的光子数计入到相关的通道,而每一个通道都有自己确定的时间tk和通道宽度($t)。

仪器响应函数也被称之为光源函数,实际工作中以胶体SiO2(商品名Ludox)为虚拟样品进行测定,所得到的衰减曲线就是图中的L(tk),光源

图4 PPD的荧光衰减曲线及其拟合

函数表明了仪器能够测定的最短荧光寿命。就仪器响应函数来讲,靠近横坐标左侧的主尖峰为Ludox的散射峰,其半高宽仅为60ps左右。而右边的小峰是由光电倍增管所引起的,其强度约为主峰强度的0105%,对实际测定影响不大。

图中第二条曲线为样品的实测荧光衰减曲线N(tk),实际上为L(tk)与脉冲响应函数I(t)的卷积,即:

N(tk)=L(tk)áI(t)

(7)

第三条曲线是实测荧光强度衰减曲线的拟合函数Nc(tk)。利用解卷积的办法有可能得到脉冲响应函数I(t),进而求得描述样品荧光衰减本质的荧光寿命(S)等有关参量。

213 卷积积分

测定得到的荧光衰减曲线是仪器响应函数和真实荧光衰减函数的卷积。假设样品被一个无限http:PPchina.chemistrymag.org 化学通报 2001年第10期#635#

窄的脉冲(D函数)所激发,而且仪器也为瞬时响应(D响应),则响应函数I(t)就是样品的真实荧光衰减函数。然而实际上没有这样的仪器,真实仪器的响应多在几个纳秒,而且光源脉冲也有一定的宽度,因此可以认为实际激发脉冲是由一系列具有不同振幅的极短脉冲(D函数)所构成。每一个短脉冲激发产生一个脉冲响应,响应的强度正比于脉冲强度(D函数振幅)。据此可以认为实验测到的N(tk)是由一系列具有不同振幅、在不同时间发生的D函数引发的脉冲响应的总和。

假定一个极短脉冲在tk引发一个脉冲响应,则上述思想可用数学式表示为:

Nk(t)=L(tk)I(t-tk)$t (t>tk)

(8)

其中I(t-tk)为相应于D函数脉冲数激发的响应函数,Nk(t)为I(t-tk)与仪器响应函数L(tk)的卷积。实验测定荧光衰减函数N(tk)可看作是一系列Nk(t)的加和。

t=t

k

N(tk)=

t=0

EL(t

t0

k

)I(t-tk)$t

(9)

当$t足够小时,可将上式写作为积分形式

N(t)=

QL(tc)I(t-QL(t-0t

tc)dtc(10)

此式表明:实验中在时间t所测到的荧光强度可以表示为在此之前所有D函数所引发的荧光的总和。以tc=t-L对上式进行变量代换,得到下式。

N(t)=

L)I(L)dL

(11)

由此可见荧光衰减的数据处理实际上就是设法找出脉冲响应函数I(L)。214 数据分析

数据分析的目的在于,通过拟合实验所得荧光衰减曲线,建立一种最能揭示荧光衰减本质、描述衰减过程的理论模型,从而对所研究体系作出深刻的理解。随着时间分辨荧光技术日益发展,人

[14][15]

们相继提出了多种荧光衰减数据分析方法。例如:非线性最小二乘法、矩法、Laplace变换[16][17][18]法、最大熵法以及正弦变换法等。限于篇幅,本文仅介绍普遍使用的非线性最小二乘法。

以一个适当的数学表达式为模型描述所要分析的数据,通过变换模型中的有关参量使计算衰减曲线Nc(tk)与实验测定衰减曲线N(tk)尽可能吻合,拟合好坏与拟合优度(goodness2of2fit)参数(V)大小密切相关。

n

2

V=

2

k=1

E

12

2[N(tk)-Nc(tk)]=Rk

n

k=1

E

[N(tk)-Nc(tk)]2

N(tk)1P2

(12)

式中n为实验数据组数或多道分析仪开通的通道数,Rk为第k个数据点的标准偏差。根据Poisson分布,每一个通道数据的标准偏差应该是其中所记录光子数的均方根,即Rk=[N(tk)]

。也就是

2

说一个通道对拟合优度参数的贡献为1。因此,一组高质量荧光衰减实验数据的拟合优度参数V应接近于实验数据组数。

2

如果选用多指数函数为模型函数,则拟合过程中需要通过改变参量Ai和Si使V最小(参见方程9)。具体讲就是以Gauss2Newton或其它算法改变Ai和Si两个参量,得到假定衰减函数I(t),然后将其与仪器响应函数卷积,卷积结果与实验测定N(tk)进行比较,直到两者之差最小,这一过程称之为解卷积。为了便于判断拟合好坏,通常用下式折合拟合优度参数V。

VR2=

V2V2

=n-pM(13)

2

式中n为实验所用MCA通道数(或实验数据组数),p为模型式中的变量数,M为自由度数。显然,

2

好的拟合结果相对拟合优度参数VR应接近1。实际工作中,应当注意将数学拟合与直觉观察结合起来,也就是说,除了VR应尽可能接近1外,各数据点的标准偏差应沿零轴呈均衡分布(参见图2

#636#化学通报 2001年第10期 http:PPwww.chemistrymag.org

4),另外也要防止将简单过程复杂化,能用简单函数拟合的决不可以用复杂函数拟合。

3 荧光寿命测定的应用

荧光技术分为静态荧光技术和时间分辨荧光技术。静态荧光技术固然重要,但是静态技术给出的只是平均化结果,平均化过程丢掉了有关分子运动的动态信息。例如在蛋白质或合成高分子

研究中,不管实际荧光各向异性衰减多么复杂,静态荧光各向异性测定总是假定体系荧光各向异性衰减是单指数的,而实际上大多数大分子体系荧光各向异性衰减都是多指数衰减,这样就掩盖了实际体系的复杂性,丢掉了实际体系中荧光物种所处环境的差异性等信息。通过研究大分子体系荧

[19]

光各向异性的实际衰减曲线可以得到有关大分子构象和链段柔性大小的信息。同样荧光强度衰减曲线也包含着十分有用的信息。例如生物大分子和合成高分子在溶液中往往具有多种不同的构象,因此相应的荧光衰减应该表现为多指数衰减形式。用时间分辨荧光各向异性研究供体和受体间的能量转移时,不仅可以得到能量转移效率,而且可以揭示受体在供体周围的分布形式。利用时间分辨荧光技术可以揭示荧光猝灭是自由扩散控制还是特异性结合控制。实际上许多分子间或分子内的弱相互作用信息,特别是动态信息,只有通过时间分辨荧光技术才能得到。例如表面活性剂类两性分子在溶液或界面上的组装、纳米材料在储存过程中的相互聚集、蛋白质或其它大分子在固液界面吸附过程中的构象调整、大分子与大分子,大分子与小分子,大分子与金属离子等相互作用所引起的大分子构象变化以及这种变化发生的程度和部位等重要问题都有可能通过时间分辨荧

[20]

光技术进行深入研究。此外,近年来时间分辨(荧光)成像(Time2ResolvedImaging)技术在临床检验上也获得了越来越广泛的应用。生物芯片技术的一个重要内容就是利用芯片上荧光标记物与待测液中底物的特异性作用实现对待测物的高效检测。

我们相信随着时间分辨荧光光谱仪的日渐普及和我国合肥同步辐射加速器分时光谱站使用效率的逐渐提高以及北京和上海同步辐射加速器分时光谱站的建立,时间分辨荧光技术必将会在未来的研究中发挥越来越重要的作用。

参

考

文

献

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