在工业化酿造发酵中氨基酸的吸收和酵母基因的转录
摘要：在酿造麦汁发酵过程中酵母对氨基酸的利用，影响所有的发酵行为和成品的风味特性。为了更好地理解酵母细胞和麦汁氨基酸组成之间的关系，使用低聚核苷酸微陈列芯片测量在工业化发酵过程中与氨基酸吸收和利用相关的基因转录的变化。对于氨基酸来说有窄特异性的氨基酸透性酶，在发酵开始有最低的转录值（当氨基酸足量时），暗示产生了蛋白降解物阻遏。而在发酵开始相对高的转录仅局限于带有宽底物特异性的基因编码透性酶存在。与氨基酸分解代谢有关的基因在转录中显示了明显的变化，在60小时时有最高的活性。除外的是PUT1（编码脯氨酸氧化酶）和CHA1（L－丝氨酸脱氨酶），两者在发酵开始时都转录较弱。证明在发酵最终阶段能提高活性的唯一基因是苏氨酸醛缩酶－编码基因GLY1——这是能解释苏氨酸非典型低吸收的一个结果。与氨基酸生物合成有关的大多数基因，在低氨基酸浓度时都有最大的表达。明显例外的是与中心氮代谢有关的基因(GLN1和LYS9)及与谷氨酸和谷氨酰胺合成有关的基因(GDH1)——与麦汁中谷氨酰胺早期消耗相一致的一个结果。同时，这些基因受与转录有关的氮降解产物响应因子所调节，这个事实也支持了上面的结果。
关键词：氨基酸，酿造，发酵，转录，酵母。
啤酒厂（所有麦芽）麦汁包含一批可同化氮源，它的氨基酸是最丰富的，麦汁包含所有的生理活性氨基酸，尽管氨基酸含量可能依据麦汁类型不同而有所变化，但不同氨基酸的总比例趋向于保持相对稳定。这些氨基能按顺序被吸收，虽然吸收的顺序可能决定于菌种的优先选择。
氨基酸的吸收是通过大量的横跨膜的氨基酸运输机进行的，这些运输机的大多数都有很窄的底物专一性并且有时仅仅运输一种单一的氨基酸。任何氨基酸当它进入细胞后，它的命运取决于大量的生理和环境因素，并且众所周知，麦汁中氨基酸的组成影响生物量的积累、生产率和发酵期间的酵母活力。另外，氨基酸的组成影响啤酒中风味物质高级醇、连二酮和酯的含量。总氨基酸含量和组成一样，也是很重要的，因为在现代啤酒厂发酵中使用糖辅料对氮/碳比率有影响，降低了氮/碳比，潜在地限
制了酵母生长，迫使得补充氮源。因此提高对氨基酸吸收和同化知识的理解，对于使工艺参数和发酵性能达到最佳化是必须的。
尽管氨基酸对发酵和风味有影响，但是我们对改变麦汁中的氨基酸酵母的转录响应所了解的知识局限于小规模发酵研究，不可能精确地反映出工业化生产的条件。对于麦汁中氨基酸的变化与基因转录之间的关系的更好地理解，可以更有效地用于改良酿造工艺和酵母处理的实践中。单独基因或者属于特殊功能组的基因的活性能切实可行地用作发酵的生物标志，或者将来可以潜在地影响到提高酵母发酵效率的战略上。在此，我们报告了在大生产规模发酵期间与氨基酸运输、分解代谢和生物合成有关的基因转录差异，这个结果被认为与所知的单独基因的调节机制相关。
实验
酵母取样
储藏啤酒酵母菌株CB11的三份样品收集于3275百升麦汁发酵的酵母，一个锥形发酵罐装有6批次充氧麦汁，每批次产量在520百升至570百升之间。采用高浓发酵（17ºP，80％的麦芽和20％的麦芽糖浆辅料），每升麦汁中添加0.2mg的锌（以ZnSO4·7H2O形式)，麦汁进罐前在线充氧，使溶解氧（DO）达25mg/L，一个在线溶解氧测定仪用于测定DO，在第二锅和第四锅添加酵母。第一个分析的样品是第一批次含有酵母的麦汁进罐后11小时和酵母添加完毕后5小时的样，这个样被称作8小时（中值）样。发酵罐的取样点位于锥体上方1m处柱体面上，取样阀是一个卫生针形取样阀。在酵母添加之后102小时内间隔取样，酵母在5分钟之内在4℃下送到实验室，用离心机在4℃下分离麦汁和酵母细胞，用于RNA提取的酵母细胞在液氮上快速冷冻并在-80℃下贮存直到用时为止。
细胞密度和出芽率
细胞悬浮液被稀释到合适的体积，细胞密度使用计数室和200×放大倍数的光学显微镜进行测量，为了测定出芽率，用显微镜最少观察500个细胞，计算出出芽细胞的数量，并算出百分率。
游离氨基氮和氨基酸的分析
游离氨基氮（FAN）使用茚三酮方法测定，此方法测定氨基酸和氨，也测量多肽和蛋白质中的一些端基α－氨基氮。氨基酸被从麦汁样品中分离并使用氨基酸工具包进行衍生。25-μL的样品与作为内标的20nmol的戊氨酸组合，此溶液被使通过工具包的固相萃取吸收剂（包含在吸液管顶端内），随后用200μL的丙醛洗脱，然后丙醛和氢氧化钠溶液（200μL）用于去除吸液管顶端的吸收剂（氨基酸保留在上面）。氯仿（50μL）和异－辛烷（100μL）然后被加到溶液中以衍生氨基酸，氨基酸被覆盖在上部的有机层中，在用气相色谱－质谱（GC－MS）分析前，此层被弄干并且样品再次被溶解于100μL的异－辛烷/氯仿中(80:20, v/v)。对于GC－MS，使用自动进样器，样品以不分流模式注射进样。气相色谱注射器维持在250℃，加热炉起初温度90℃，以每分钟20℃速率升到320℃（从加热炉到质谱的传输线温度在300℃）。氦（12psi）被用作载气从柱上（10 m × 0.25 mm i.d.）洗提氨基酸，以选择离子法操作质谱仪，以驻留时间0.03秒记录离子101,114,116,130, 144, 146, 155, 156, 158, 172, 180, 184, 243和244，Calibration was achieved by comparison
of peak areas for the amino acids in standard and sample runs after
adjustment for variation in the peak area of the internal standard.
RNA处理、杂交和数据收集
选择发酵的5个时间点（添加酵母之后8，30，60，80和102小时）用于微阵列分析，所有分析都进行三次（来自发酵罐30小时的样品除外，只有两次样品可用），每一次都分别进行处理，总共14个
样品用于研究，
