基于SNP标记的关联分析在玉米耐旱研究中的应用_郝转芳

作物杂志　Crops2009.6

基于SNP标记的关联分析在玉米耐旱研究中的应用

郝转芳　苏治军　李亮　张世煌　李新海

(中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程,100081,北京)　　摘　要　单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)标记的发展促进了关联分析对植物复杂数量性状的遗传研究。研究证明:多数SNP变异与基因功能密切相关,通过关联分析可以发掘这些功能型位点变异并应用于作物遗传育种。因此,本文综述了近些年来在玉米上利用SNP标记进行关联分析的研究进展,展望了其在耐旱分子育种和遗传网络解析方面的应用前景。

关键词　单核苷酸多态性(SNP);关联分析;玉米;耐旱

玉米是重要的粮食、饲料及工业原料作物,随着全球经济发展,在未来的十几年内对玉米的需求量还将大幅度增加

[1]

遗传机制的复杂性,同时也为进一步探索其遗传规律奠定了基础。但是,传统QTL定位方法存在一些局限性,诸如需要构建庞大的作图群体,对分子标记饱和度需求过高以及定位的置信区间较大等,给耐旱研究增加了难度。近年来,人类疾病遗传学研究发现,利用反向遗传学克隆的功能候选基因,通过分析原始遗传材料的序列变异与表型性状之间的相关性可以获得与功能相关的遗传变异位点,从而基因表达

[7]

。在此基础之上,发

展出一种基于连锁不平衡(Linkagedisequilibrium,LD)的关联分析方法(Associationanalysis),成为对传统QTL定位方法的有效补充

[8]

。与传统QTL分

析方法相比,关联性分析有以下优点:一是利用现存的自然原始材料而不必通过双亲杂交产生的作图群体,这就节省了大量费用,尤其对于生长周期长的物种是非常节省时间的;二是在每个位点可以发掘大量的多态性等位基因,而传统的QTL定位只是针对一个位点的两个等位基因;三是通过检测原始材料在以往世代减数过程中的重组频率,通过LD分析,可以达到很高的定位精度。在分析多样性丰富的玉米自交系时,可以精确定位到染色体某一区段,甚至达到2000bp的精度,或者直接与某功能基因相关联

[9]

。由于全球范围内降水量

[2]

逐渐减少和分布不均导致干旱频繁发生,严重影响了玉米产量的持续增长

。在我国,干旱半干

旱耕地面积占到总耕地面积的一半以上,玉米生长季节降水偏少,灌溉设施不够完善,制约着玉米产量提高。实践证明,培育耐旱玉米品种是应对干旱威胁的重要策略。

作物耐旱性属于复杂的数量性状,传统耐旱育种研究进展缓慢。国际玉米小麦改良中心(CI-MMYT,Internationalmaizeandwheatimprovementcenter)研究认为,借助于分子遗传和分子生物学手段,加强对植物耐旱关键生理过程和遗传机制的认识,将会加速耐旱育种研究进展。目前,通过QTL(Quantitativetraitloci)遗传定位已经在玉米10条染色体上发掘出大量控制耐旱性的相关基因位点

[3,4]

。基于这些优

点,近年来,结合新型SNP(Singlenucleotidepoly-morphism)分子标记技术,关联分析方法被广泛应用于研究植物复杂的数量性状。

1　关联分析的遗传解释

关联分析,亦称作连锁不平衡作图(Linkagedisequilibriummapping,LDmapping),是一种研究复杂数量性状的遗传方法。这种方法主要基于两个位点间等位基因的非随机共分离现象,即LD概念,利用群体内的原始重组和自然变异来研究数

1,而且通过图位克隆技术已获得一些模式植

[5,6]

物QTL的基因序列。这不仅验证了玉米耐旱

作者简介:郝转芳,助理研究员,研究方向:玉米耐旱分子生物学

李新海为通讯作者,研究员,研究方向:玉米遗传育种

基金项目:国家自然科学基金(30600394;30721140554)收稿日期:2009-10-18;修回日期:2009-11-17

2009.6量性状

[10]

作物杂志　Crops

。与基于两个亲本杂交通过后代重组几

对11个玉米栽培种和7个原始种进行研究,在调节基因(bgene)中发现了116个SNP和30个插入片段(1～15bp)。Rafalski等

[16]

率进行连锁分析相比,关联分析侧重于研究个体之间彼此并无关系的群体,因此,比连锁分析具有更高的作图精度,可以直接找到目标基因变异,因而被广泛应用于复杂数量性状的遗传分析,如人类的遗传疾病探索以及植物的非生物抗性。

LD概念是用来描述等位基因间的非随机关联,由重组、连锁、变异和遗传漂移等引起。统计参数r是一种与频率有关的度量,被用来定义两位点间的LD水平

[11]

2

报道,在玉米基因

组序列中估计平均每70bp有1个SNP。在对玉米EST(Expressedsequencetag)序列的SNP分析中,Bhattramakki等

[17]

以8个差异明显的玉米自交系

基因组DNA序列为模板,用特异引物扩增源于EST的502个基因座,对所得到的400～500bp的PCR产物测序表明,86%基因座的PCR产物具有SNP多态性,52%基因座在玉米自交系B73和Mo17之间存在SNP多态性。Batley等

[18]

。当r是1时,表明两个位

2

点间等位基因没有被重组分开(完全的连锁不平衡),LD值最高,各等位基因频率相同,群体内只能出现两种单体型。当r是0时,表明两个位点间等位基因发生重组(连锁平衡),LD值最低,等位基因频率不等,群体内会产生多种单体型。另外一种衡量LD的方法是D′,用于说明配子体间最大限度的不平衡程度,一般多用于小样本研究。关联分析即是利用等位基因间LD的统计特性去预测染色体某个区段决定表型性状的关联程度。如果在某群体内围绕一个标记位点的染色体区段比预期的LD高,那么位于这个区段的多态性标记与特定表型存在关联

[10]

2

直接分

析了102551个玉米EST序列,获得了14832个候选的多态性SNP和InDel,在3′-UTR(3′-untrans-latedregions)区域中,每48bp出现1个SNP,而在编码区域内平均每130bp出现1个SNP。最近,Jones等

[19]

基于60个自交系材料从1088个基因

序列中发掘了2140个InDel和9194个SNP,其结果将用于商业化玉米种质选育。上述研究表明,在玉米基因组中不仅在基因的非编码区域,而且在基因编码区域均存在丰富的SNP。

目前,利用SNP标记技术,已经分别从全基因组关联分析和候选基因关联分析两个方面对玉米复杂数量性状遗传变异开展了大量的研究。全基因组关联分析是通过高通量的SNP遗传标记检测基因型频率和表型性状之间的关联,由此在DNA样本中发掘基因组序列相对普遍存在的变异来诠释目标性状

[20]

。根据研究的目的和范围

大小,关联分析可以分为两种类型,即全基因组关联分析(Genome-wideassociationstudyorGenome-wideassociationmapping,GWAS)和候选基因关联分析(Candidate-geneassociationmapping)。全基因组扫描策略通常利用分布于全基因组染色体上的标记去寻找不同数量性状与基因型之间的关联,而基于候选基因的关联分析是采用已知目标候选基因高分辨率地检测关联变异位点

[12～14]

,因此,特别适合于研究多位点控制

的数量性状及其等位基因遗传结构。自2005年第一篇有关年龄相关的视网膜黄斑变性的GWAS研究报道以来

[21]

。

,大规模、高通量的GWAS研究

2　基于SNP标记的关联分析在玉米上的研　　究基础

近年来,新型SNP分子标记技术的发展促进了关联分析在植物上的应用。研究发现,在禾谷类作物中,玉米是进行功能候选基因SNP关联分析的理想物种,其原因为玉米是杂交作物,重组率高,遗传多样性丰富,这样用少量的标记就可以检测整个基因组,而LD程度却很低(<1kb)。同时,玉米基因组中含有丰富的SNP。Selinger等2[15]

[9]

逐步提高了人类对许多复杂性状遗传基础的认识。截至目前,已经有200多篇关于常见易感疾病GWAS的报道,超过250个基因位点被认为与多基因控制的目标性状有关联

[22,23]

。由于GWAS

所需标记量较大,需要覆盖到整个基因组序列,因此,对于各个物种基因组成千上万个SNP标记就需要大通量芯片技术,这样既经济高效又节省时间。在玉米上,Illumina公司与美国Cornell大学Buckle实验室联合开发了针对玉米全基因组的包含1536个SNP的随机基因型分析芯片,而且采

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用NAM(巢式关联分析方法,Nestedassociationmapping)结合26个巢式作图群体对其中的1000多个SNP进行了遗传定位,构建了高密度的SNP标记遗传连锁图谱,对于使用该芯片的功能基因组研究提供了实用的信息(http://www.panzea.org/)

[14,24]

2009.6

与作物耐旱性相关,并用于遗传研究,基因克隆和功能机制验证,尤其是进行耐旱功能代谢机理研究

[25]

。大量功能序列的研究和探索不仅促进了复

杂数量性状候选关联分析,同时也为上述GWAS功能芯片的开发和利用提供了前提和发展空间。Rafalski报道玉米基因组中许多SNP变异与基因功能息息相关,尤其是在适应性方面起着决定性的作用,截至目前,已经有大量基于SNP标记的候选基因关联分析应用在不同作物复杂性状的研究报道(表1)

[14]

[16]

。针对玉米耐旱性,CIM-

MYT利用将近600个耐旱相关基因的10000个SNP设计了玉米耐旱芯片,对来自全球多个国家的350份自交系进行了关联分析,找到了与玉米耐旱相关的代谢和农艺性状候选基因及其变异位点,这些候选基因都与玉米耐旱代谢遗传网络相关。人类基因组计划完成的时间较早,GWAS研究需要高通量大规模的标记来发掘微小等位基因变异,目前仅见到对人类研究的报道,植物上仍未发表与此相关的突破性进展。据了解,玉米1百万SNP的基因芯片正在设计中,预计不久的将来可以供科学研究应用(私人通讯)。

候选基因关联分析将可以精细到对遗传网络中的关键酶基因进行遗传变异研究,发掘优势单体型,从而基因表达。在过去的十几年内,随着人类、水稻、玉米和高粱大规模DNA测序项目的启动和反向遗传学技术的不断突破,涌现出了大量的基因组调查序列(GSSs,Genomesurveyse-quences)和表达序列标签(ESTs,Expressedse-quencetags),其中与玉米相关的序列达到了500万(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/)。这些序列为候选基因关联分析奠定了基础。在这些序列中,现已经有500多个功能候选序列被认为

性状

开花时间/株高

基因Dwarf8

。在玉米中,首次应用候选基因

关联分析的例子是通过SSR(Simplesequencere-peat)标记研究玉米的开花时间和dwarf8基因的单倍型

[26]

。随后SNP关联分析逐渐成功地用于检

[27,28][30]

测复杂性状,并应用到实用化研究中2004年,Guillet-Claude等

[29]

。如分别

和Wilson等

对玉米过氧化物酶基因ZmPox3和玉米子粒组成与淀粉生产之间的关联性分析。Palaisa等

[31]

研究了

氢番茄红素合成酶基因单体型与胚乳颜色之间的关系。2005年,Flint-Garcia等利用302个玉米自交系对产量构成因素等数量性状位点的关联性分析方法做了系统的研究含量的全基因组关联分析bastiani等

[33]

[9]

。2008年,Beló等用。在耐旱研究上,Se-

8590个SNP对553个原始玉米材料进行了油酸

[32]

报道用SNP分析地中海白松的9个

耐旱候选基因,结果已用于耐旱遗传分析和QTL作图。本文作者利用1536个SNP标记分析了3个重组近交系群体和106份近等基因导入系,通过连锁和关联分析共同发现了5个耐旱相关的

材料数9271650

标记数141555519247

标记类型

[26]

SSR[34]SNP[35]SSR/Indel[36]SNP/Indel[31]SNP/Indel

表1　关联分析在玉米遗传研究中的应用[14]

开花时间

子粒组分和淀粉加工特性饲用品质黄色胚乳maysin甜玉米油酸含量维生素A含量

Vgt1(Vegetativetogenerativetransition1)

bt2/sh1/sh2/ae1/waxy1(brittle2/shrunken1/shrunken2/amylase

extender1)PAL(PhenylalanineAmmonia-Lyase)Y1

a1/c2/whp1(anthocyaninless1/colorless2/whitepollen1)Sugary1

fad2(fattyaciddesaturase)lcyE(lycopeneepsiloncyclase)

9510232758657553228

[37]

SequencingSNP[31]SequencingSNP

14150553

[38]

SNP/Indel

[39]

SequencingSNP

[32]

SNP[40]SNP/Indel

32009.6作物杂志　Crops

SNP的出现引导着功能基因组研究的发展,逐渐提高了分子标记在作物育种中的选择效率Andersen等

[46]

[16]

SNP变异及其基因序列(未发表数据)。由此显示出关联分析在解析复杂数量性状遗传网络及其关键基因上具有重要应用价值

[16]

。

。将来源于功能型序列的DNA标记

3　基于SNP的关联分析在玉米耐旱研究中　　的应用

3.1　玉米耐旱功能型分子标记辅助育种

分子数量遗传学的发展促进了分子标记的更新和高密度遗传连锁图谱的构建,发掘出大量与数量性状相关的QTL,同时也促进了MAS在数量性状选择上的应用。尽管文献报道的QTL数目在逐年增多,但MAS应用成功的例子却很少。目前玉米上仅在一些效应比较大的QTL,主要是抗病基因方面有成功例子,如大豆孢囊线虫上SSR标记sat309的应用和对小麦赤霉病3BS染色体上一个主效QTL的选择

[41～43]

称作功能型标记。功能标记由于是从目的基因的功能位点开发,因而可靠性强,前期不需要构建作图群体,不存在遗传重组带来标记与性状之间的无关联而产生的风险,而且能够最好地代表遗传变异,它可以准确地跟随等位基因,因此非常适合在作物育种中进行标记辅助选择

[47]

。研究发现,

不同物种中许多SNP变异无论在结构还是在调节基因中都是表型变异的驱动者,决定了种质的差异。因此,如果我们在功能候选基因中通过关联分析检测到功能SNP变异位点,并推测出其在代谢途径中所起到的关键作用,然后根据基因的诱导型变异信息及遗传变异规律开发出功能型分子标记,可以用于玉米耐旱MAS和育种应用(图1)。

。MAS在玉米上主要是

利用3个SSR标记umc1066,phi057和phi112对优质蛋白玉米o2基因的选择,目前,CIMMYT正在发掘和鉴定与优质蛋白相关联的修饰氨基酸的有效标记来进行辅助选择,研究o2基因与其互作修饰氨基酸的相互关系(私人通讯)。在玉米耐旱研究上,报道的只有Ribaut等

[1]

利用标记辅助回交

[36]

育种,对具有与亲本相同背景的后代进行逐代检测,选择出比对照耐旱的优良品系。Salvi等

在

玉米开花时间QTL内克隆的Vgt1基因与耐旱相关。目前并未检测及发展出比较实用的耐旱分子选择标记。Collard等

[44]

列出了MAS低效率应用

的原因,其中最主要的两个制约因素就是分子标记的低通量和MAS的高费用。

　　SNP关联分析以其高通量的检测水平和高效率的功能型分子标记被认为是解决标记辅助选择问题的有效途径。分子标记最早应用在作物育种上应该追溯到19世纪80年代同功酶,用于从外来种质中导入单个性状到栽培种

[45]

图1　关联分析在玉米耐旱分子育种上的应用

3.2　玉米耐旱遗传网络解析

对于简单的单基因控制的性状,单个的一个遗传敲除实验就可以解释其机理,但是对于多基因控制的复杂数量性状,多数受环境的影响比较大,单一的分子遗传学实验无法解决其复杂的遗传变异和代谢机理。目前,关联分析被研究用于解析这些性状的复杂遗传代谢网络。Torka-mani等

[48]

。其后,相继经

历了RFLP(性片断长度多态性,Restrictionfragmentlengthpolymorphism),SSR(简单序列重复,Simplesequencerepeat),RAPD(随机扩增多态性DNA,RandomlyamplifiedpolymorphicDNA),AFLP(扩增片断长度多态性,Amplifiedfragmentlengthpolymorphism)等多种分子标记。20年后,4通过一系列从数据准备和整理,SNP分

析以及代谢途径探索等步骤模拟了关联分析用来解析复杂性状遗传变异的可能性。在干旱胁迫环境下,植物体内会产生一系列生理和生化反应来抵御体内失水,这些反应包括气孔关闭、细胞生长

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受阻、光合作用受阻、蒸腾作用激活等。为了生存,植物通过在细胞和分子水平上膜结构的变化和不同物质的调节而产生耐旱性来适应干旱胁迫,维持正常生长发育,在此调节过程中亦涉及到许多诱导和组成型基因的表达

[49]

2009.6

分析方法为玉米耐旱遗传机理的研究提供了契机。随着玉米基因组测序的完成,利用基因芯片技术,通过关联分析发掘这些耐旱代谢途径中关键基因SNP变异位点,找出功能性变异位点,由此有助于解析耐旱的复杂遗传网络。最近,Manicac-ci等利用SNP关联分析方法揭露了o2基因转录启动区与其目标基因CyPPKK1之间的上位性互作

[50]

。根据植物对干

旱胁迫所做出的一系列形态生理变化,耐旱代谢途径主要涉及到信号转导、ABA合成和降解、糖类及其他功能蛋白的代谢,每个代谢途径均涉及到大量基因的表达(图2)。尽管对于所有作物而言,耐旱性是一个复杂的数量性状,但是SNP关联

。因此,随着关联分析方法和芯片技术的不

断发展,基于SNP标记的关联分析将会促进对玉米耐旱性复杂遗传机理研究的逐步深入。

作物在干旱胁迫下首先受到细胞脱水的影响,在原初信号传导下,作物通过增加吸水能力,降低蒸腾作用等表观变化来防止脱水伤害,同时生物体内通过生物膜结构功能、渗透调节反应和抗氧化作用等来抗脱水,这些生物体内的反应依赖于脯氨酸、糖类等物质的合成和降解以及ABA调节来实现,最终受基因的。PIPIP5CS,Delta2,二磷酸磷脂酰肌醇;2,二磷酸肌醇;P(1)-pyrroline-5-carboxylatesynthetase;P5CR,Delta(1)-pyrroline-5-carboxylatereductase;ProDH,prolinedehydrogenase(oxidase);ABA,abscisicacid;MYB,MYC,drought-responsivecis-actingelement;NAC,transcriptionalfactorswithNACdomain;AREB,ABAre-sponseelement;RD,dehydrationresponsivegenes;DREB,Dehydrationelement-bindingelement.

图2　玉米耐旱遗传机理[49,51]

52009.6作物杂志　Crops

8SalviS,TuberosaR.TocloneornottocloneplantQTLs:presentand

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4　展望

玉米作为同株异花作物,基因组含有丰富的遗传变异,由于其易通过自交构建分离群体和永久基因型而成为近年来连锁分析和关联分析的模式作物

[24]

。2008年,通过连锁和SNP关联分析,

在类胡萝卜素合成途径中决定Pro-vitaminA含量的两个关键基因lycopeneepsiloncyclase(lcyE)和Hydroxylase-b1(Hydb-1)被发掘和验证,并且分别开发出实用的SNP功能标记,目前CIMMYT正在利用开发的两个功能标记在不同背景材料中进行分子育种验证。此研究为复杂性状的功能分子标记辅助育种提供了借鉴,为玉米耐旱关联分析方法和分子育种实践创造了条件

[40]

。

多年来,当传统的育种技术倾向于聚合多个目标性状以获得更高产量的同时,选择和加代致使材料的遗传增益在逐渐降低,多样性丧失

[45]

。

考虑到作物耐旱性是一个复杂的数量性状,涉及到生理、生化和遗传变化等多个方面。因此,在保持玉米遗传多样性的基础上,通过分子遗传和分子生物学等手段,基于SNP标记的关联分析进行全基因组候选基因扫描以及开发和验证基因中的SNP功能型标记将有助于促进玉米耐旱遗传和分子育种研究。

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2009.6

evolution:Exampleofsugary1andtheoriginofsweetmaize.Crop

Sci,2006,46:S49～S5440HarjesCE,RochefordTR,BaiL,etal.NaturalGeneticvariationinlycopeneepsiloncyclasetappedformaizebiofortification.Science,2008,319:330～33341ConcibidoVC,DiersBWArelliPR,etal.AdecadeofQTLmap-pingforcystnematoderesistanceinsoybean.CropScience,2004,44:1121～113142AndersonJA,ChaoSandLiuS.MolecularbreedingusingamajorQTLforFusariumheadblightresistanceinwheat.CropScience,2008,47:S112～S11943BernardoR.Molecularmarkersandselectionforcomplextraitsinplants:learningfromthelast20years.CropScience.2008,48:19～14CollardBCY,MackillDJ.Marker-assistedselection:anapproachforprecisionplantbreedinginthetwenty-firstcentury.PhilosophicalTransactionsoftheRoyalSocietyBiologicalSciences,2008,363:557～57245XuY,CrouchJH.Marker-assistedselectioninplantbreeding:frompublicationstopractice.CropScience,2008,48:391～40746AndersenJR,LǜbberstedtT.Functionalmarkersinplants.TrendsinPlantScience,2003,8:554～56047XuY,McCouchSR,ZhangQ.Howcanweusegenomicstoimprovecerealswithriceasareferencegenome?PlantMolecularBiology,2005,59:7～28TorkamaniA,ShorkNJ.Pathwayandnetworkanalysiswithhigh-densityallelicassociationdata.MethodsinMolecularBiology,2009,563:2～30149ShinozakiK,Yamaguchi-ShinozakiK.Genenetworksinvolvedindroughtstressresponseandtolerance.JournalofExperimentalBota-ny,2007,58:221～22750ManicacciD,Camus-KulandaiveluL,fourmannM,etal.Epistaticin-teractionsbetweenOpaque2transcriptionalactivatoranditstargetgeneCyPPDK1controlkerneltraitvariationinmaize.PlantPhysiolo-gy,2009,150:506～52051KaurN,GuptaAK.Signaltransductionpathwaysunderabioticstres-sesinplants.CurrentScience,2005,88:1771～1780

ApplicationofAssociationAnalysiswithSNPMarkers

onStudiesofDroughtToleranceinMaize

HaoZhuanfang,SuZhijun,LiLiang,ZhangShihuang,LiXinhai

(InstituteofCropScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,NationalKeyFacilitiesforCropGenetic

ResourcesandImprovement,100081,Beijing,China)

Abstract　ThedevelopmentofSNP(Singlenucleotidepolymorphism)promotedtheapplicationofassociationa-nalysisongeneticresearchofcomplexquantitativetraits.StudieshaveprovedthatmostSNPvariationsarehighlycorrelatedwithgenefunctionandthesefunctionalvariationscanbeidentifiedbyassociationanalysis.ThroughoutthestudiesofSNP-basedassociationanalysisonmaizegeneticsintheserecentyears,thispaperoverviewedtheap-plicationopportunitiesofSNP-basedassociationanalysistomolecularbreedingandgeneticnetworkfordroughttol-erance.Keywords　SNP(Singlenucleotidepolymorphism);Associationanalysis;Droughttolerance;Maize

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