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白头翁汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜损伤修复作用的影响

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第11卷第4期・总第156期 20 1 3年2月・下半月刊 ◎ 墨 白头翁汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜损伤修复作用的影响 李云海 (湖北中医药大学,武汉430061) 摘要:目的观察加味白头翁汤对TNBS局部灌肠加高脂高糖法UC大鼠模型结肠黏膜形态的影响,对其黏膜损伤修复作用机制进 采用加味白头翁汤、及西药SASP对UC大鼠模型进行治疗,治疗结束后采集结肠黏膜标本,首先肉眼观察结肠黏膜 行探讨。方法组织,按组织损伤评分标准进行评分,进行组间比较分析。然后将结肠组织石蜡包埋,HE染色,光镜下进行观察。结果型组比较,差异显著(Pd0.o1);与西药对照组比较,无显著性差异(P>0.05)。结论关键词:白头翁汤;溃疡性结肠炎;结肠黏膜修复 doi:10.3969/j.issr ̄1672-2779.2013.04.109 文章编号:1672—2779(2013)一04-0155—03 模型组大 鼠结肠黏膜损伤指数与正常组之间差异极显著(Pd0.01),加味白头翁汤方组可使结肠黏膜组织损伤和病理组织学评分降低,与模 溃疡性结肠炎大鼠动物模型复制是成功 的,加味白头翁汤方可抑制UC的炎性细胞浸润,使炎症减轻,同时还有促进结肠黏膜损伤修复,恢复结肠黏膜的分泌功能的作用。 溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种主要 累及结肠和直肠的慢性非特异性炎症反应。本病病情复 杂,病程较长,往往迁延难愈。目前西医治疗主要以氨 基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂为主,但副作 用较大,且效果并不理想。加味白头翁汤方是在多年临 6g,黄柏12g,秦皮12g,败酱草15g,三七9g,党参 15g,白术12g,茯苓12g,甘草6g(湖北省中医院药剂 科提供)等组成。先将药物浸泡30分钟,按照常规中草 药煎煮方法,煎煮提取2次,过滤后合并提取液,然后 于旋转蒸发仪中(真空压力、温度8012)浓缩为生药浓 床实践的基础上,以清热利湿,健脾益气,活血止痛为 治则,总结出的中药复方。经过大量临床验证,证明疗 效显著。为了进一步研究加味白头翁汤方对UC的作用 机制,我们采用采用三硝基苯磺酸(TNBS)局部灌肠加 高脂高糖法建立UC大鼠模型,并观察了加味白头翁汤 方对UC大鼠模型结肠黏膜组织的一般情况及结肠黏膜 组织形态学,以期探讨加味白头翁汤对溃疡性结肠炎结 度为2g/ml的中药原液,冷却后装入灭菌玻璃药瓶,置 于4℃冰箱保存备用;柳氮磺胺吡啶(SASP)(批号为 H11020818,山西晋新双鹤药业有限责任公司生产,每片 0.25g),将200片药物溶于500ml蒸馏水中,配成浓度 为0.1g/ml的混悬液备用;2,4,6-三硝基苯磺酸(TN— BS)(美国Sigma公司产品)的30%(体积分数)乙醇 溶液;20%氨基甲酸乙酯;10%固定液;PBS 液、Hank’s液。 肠黏膜损伤的修复作用。 1材料与方法 1.1动物4~5周龄雄性SPF级健康SD大鼠40只, 雌雄各半(由华中科技大学同济医学院实验动物中心提 供(许可证号:SCXK(鄂)201%0007),体重(180± 1.4造模方法模型采用三硝基苯磺酸(TNBS)局部 灌肠加高脂高糖法建立UC大鼠模型[1 ]。实验分两部分 进行,第一部分首先采用三硝基苯磺酸局部灌肠复制溃 疡性结肠炎大鼠模型:将动物禁食12h,腹腔注射20% 氨基甲酸乙酯麻醉,6m1/kg,固定于解剖台上,将一直 径2.0mm长约15cm的橡胶导尿管,由肛门轻缓插入深 20)g,饲养于湖北中医药大学动物实验室内,饲养环境 保持温度(22±1)℃,恒湿(50%~60%),光照黑暗交 替12小时,混合食料喂养,自由饮水。 1.2主要仪器电光分析天平(由上海天平仪器厂生产); GL-20A型高速冷冻离心机(由湖南仪器仪表总厂离心机厂 生产);高速组织匀浆仪(德国1ANKIjsd<I Ⅱ GMBH公 司提供);YC,-DZOZ亚都超声加湿器(北京亚都科技股份有 限公司产品提供);LRH-800-GS人工气候箱(广东省医疗 约lOcm,给予100m ̄kg浓度的三硝基苯磺酸一次性推 入结肠,每只0.5ml,让动物保持平躺自然清醒。第二 部分在已复制的UC大鼠模型上,建立胃肠湿热型模型: 给大鼠饲以高脂高糖饮食,即在普通饲料喂养的基础上, 自由饮用200g/L的蜂蜜水,并按大鼠体重灌服1Oral/kg 器械厂提供);UV-260型可见紫外分光光度计(日本岛津公 司提供);包埋机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司 KD-BM);冻台(武汉俊杰电子有限公司IB-LS);切片机 (上海徕卡仪器有限公司RM2016);摊片机(浙江省金华 市科迪仪器设备有限公司K/)-P);光学显微镜(日本()- lympus AHBT-5B),剪刀、手术镊、医用手套、15ml注 射器、灌胃针头(由湖北中医药大学中心实验室提供)。 1.3药物与试剂 加味白头翁汤由白头翁15g,黄连 56度白酒和油脂10 ,白酒与油脂隔日交替给予,共 10d。然后放人温度(32±2)℃,相对湿度为95%的人工 气候箱中,共5d,以造成内因湿热模型。造模同时观察 大鼠的一般情况,包括饮食、大小便、体重、皮毛、活 动情况、精神状态等并作观察记录。造模完成后每组随 机选取大鼠2只,处死后进行解剖,并截取每只大鼠病 变处结肠1~2cm,行病理超微结构观察,病理确认结肠 出现充血、水肿、炎细胞浸润、隐窝脓肿、杯状细胞减 少、腺体破坏及小溃疡形成等一系列变化。 1.5分组设计及给药将40只SPF级健康SD大鼠,随 机分为正常组、模型组、西药对照组、中药治疗组,每 组10只。动物模型制作成功后,中药治疗组给予加味白 头翁汤5.98ml/kg灌胃,西药对照组给予柳氮磺胺吡啶 3.125ml/kg灌胃,上述剂量均依据《中药药理研究方法 学》记载方法计算。模型组及正常给予等容积的生理盐 水灌胃,各组灌胃给药均每天1次,连用15d。 1.6标本采集及处理实验结束后,腹腔注射20%氨基 甲酸乙酯麻醉,6ml/kg,固定于鼠解剖台上,剖取整个 结肠组织,先行肉眼仔细观察各组大鼠结肠黏膜的充血、 水肿、伪膜、溃疡和糜烂数目及面积病理改变情况,然 后再参照文献_3],制定以下结肠组织形态学评分标准 (见表1),并按评分标准进行评分。 表1 UC大鼠结肠黏膜组织损伤程度评分标准 分数 肉眼观察结肠黏膜组织特征 O 无损伤 1 粘膜充血、水肿、未出现溃疡 2 粘膜充血、水肿、轻度糜烂、无溃疡 3 粘膜充血、水肿、中度糜烂、有单个溃疡 4 粘膜充血、水肿、高度糜烂、有多个溃疡 5 粘膜充血、水肿、重度糜烂、有>1cm的溃疡 1.7光镜观察取距肛门7 ̄9cm处的结肠组织0.5cm, 浸蜡包埋,HE染色,光镜下进行观察。 1.8统计方法实验数据采用SPSS15.0统计软件处理, 计量资料以( ±S)表示,用单向方差分析(one-way ANOVA),组间差异采用q检验,P<0.05为有统计学 差异,P<0.01为有显著统计学差异。 2结果 2.1一般情况模型复制过程中,大鼠食量减少,体重 减轻,精神萎靡,嗜卧懒动,毛发疏松粗糙,晦暗无光 泽,大便时干时溏。 2.2大鼠结肠黏膜形态学的变化 2.2.1 肉眼观察各组大鼠结肠黏膜组织的病理变化及加 味白头翁汤的治疗作用 结肠黏膜组织形态学观察,与 模型组动物的结肠黏膜组织病理形态比较可以看出各组 大鼠结肠黏膜组织的病变都有不同程度的减轻,而加味 白头翁汤组大鼠结肠黏膜组织的充血、水肿、伪膜、溃 疡和糜烂数目及面积则较s 、P组减少。(见表2)另一 方面,加味白头翁汤组大鼠结肠黏膜组织形态学评分所 得数据,与模型组比较,差异极为显著(P<0.01),与 SASP组相比,无显著差异(P>0.05)。(见表3) 表2各组大鼠结肠黏膜组织的病理变化及加昧白头翁汤的治疗作用 组别 莲妻 正常组 10 1(±)0 0 0 0 0 模型组 10 10(+~++)lo(+~++) 4 56 18 178 西药对照组10 3(+~++)2(+~++) 1 13 2 16 1垄 塑! !:二:: !:=::! : 结果说明:1溃疡性结肠炎大鼠动物模型复制是成 功的。2中药、西药对溃疡性结肠炎均有明显的治疗作 用,其中中药治疗组优于西药对照组 2.2.2光镜下病理切片观察结果①空白对照组:大鼠 结肠黏膜组织表面很平滑、黏膜上皮完整、连续,腺体 第11卷第4期・总第156期 2 0 1 3年2月・下半月刊 分布规则、结构清楚、分泌功能活跃,黏膜层、黏膜下 层血管内压正常,肌层和浆膜无异常。②模型对照组: 大鼠造模后胃肠充气,管壁变薄,结肠出现类似于人类 溃疡性结肠炎的连续性病变,表现为黏膜高度充血水肿, 表面有坏死及溃疡形成;黏膜病理改变表现为黏膜及黏 膜下层明显水肿、纤维蛋白沉淀、中性粒细胞浸润,严 重时出现上皮坏死和溃疡。光镜下腺体排列不整齐、部 分糜烂、溃疡形成、杯状细胞减少、甚至消失,固有层 内大量中性粒细胞浸润及隐窝脓肿,其损伤指数显著增 高。③加味白头翁汤组:加味白头翁汤组腹泻停止,肉 眼观察黏膜水肿减轻,溃疡和炎性渗出物基本消失;光 镜下见结肠结构基本恢复正常完整,黏膜上皮为单层柱 状,由杯状细胞组成,固有层中腺体呈管状,可见少量 淋巴细胞及中性粒细胞,黏膜肌层、黏膜下层结构清晰, 其损伤指数显著降低。 表3各组大鼠结肠黏膜组织损伤比较殛加昧白头翁汤对 结肠黏膜组织损伤的影响 ( ±S) 注:与正常组相比, P<O.01;与模型组相比,。P<O.01;与西药对 照组相比, P>O.05 3讨论 目前已建立的UC动物模型已超过二十余种,除少 数动物有自发性肠炎模型外,大部分都是通过实验方法 造模。造模的方法有化学药物诱导、免疫学方法诱导、 细胞移植诱导、转基因方法及基因敲除等。 本实验采用2,4,6-三硝基苯磺酸局部灌肠加高脂 高糖法建立UC大鼠模型。2,4,6-三硝基苯磺酸所诱导 的结肠炎模型因其比较接近于人类UC又有较好的重复 性而被普遍使用,是目前研究UC的一个重要模型。 TNBS作为一种半抗原物质,与结肠黏膜组织中的大分 子组织蛋白结合,形成一种完全抗原,进一步引起机体 异常的免疫反应从而诱导肠炎的发生I3]。TNBS局部灌 肠模型目前在国外甚为流行,主要由于它有以下几大优 点:①致炎效果肯定,模型复制方法简单,重复性好; ②价格低廉;③急性期炎症反应虽然不如其他UC模型 明显,但慢性炎症表现突出,病变持续时间长(可达8 周),为研究慢性炎症的药物治疗创造了条件;④其致病 机制为TNBS损伤上皮屏障后由免疫系统介导其疾病的 发展,且病理及组织学改变均类似于人类炎症性肠病。 如节段、跳跃性炎症、肉芽肿性和溃疡改变常见,可见 淋巴细胞浸润、肥大细胞、巨噬细胞及隐窝变形。 TN1 局部灌肠模型建立后,本课题在已复制的UC 模型的基础上,根据溃疡性结肠炎的中医病因病机特点, 按照中医理论给大鼠饲以高脂高糖饮食,并放人高温高 湿的人工气候箱中,从而进一步造成内因湿热模型。 本课题设计旨在临床研究基础上进一步验证中药加味 第11卷第4期・总第156期 20 1 3年2月・下半月刊 白头翁汤方的疗效及深入探讨其治疗的作用机制,因此选 择合适的动物模型是至关重要的。局部灌肠加高脂高糖法 既符合UC发生的免疫学机制,又符合其肠道炎症发作期 的中医致病特点,适合进行药物疗效的作用机理探讨,因 生。提示加味白头翁汤方组可抑制UC的炎性细胞浸润, 使炎症减轻,同时还有促进结肠黏膜损伤修复,恢复结肠 黏膜的分泌功能的作用。 由此可见,加味白头翁汤方可通过减轻结肠炎症, 促进结肠黏膜修复,从而起到治疗UC的作用。‘ 参考文献 E13吕冠华,劳绍贤.脾胃湿热证动物模型的建立与评价[J].广州中医药大学学 报,2005,22(3):231. 此我们选择此方法造模。实验结果表明,模型组大鼠结肠 黏膜损伤指数与正常组之间差异极显著(P<O.01),与 许多文献报道相一致 ],说明本课题UC模型复制成功。 加味白头翁汤方组与模型组相比较:大鼠的一般情况明显 好转,大鼠脓血便和粘液便消失,大便成形,活动灵活, 食欲好转,大鼠体重明显增高。结肠黏膜组织的充血、水 肿、伪膜、溃疡和糜烂数目及面积减少。结肠黏膜组织损 伤评分数据表明,加味白头翁汤方组与模型组比较,差异 极为显著(P<0.01);与SASP组比较,无显著性差异( P>0.05)。光镜下观察,加味白头翁汤方组病理改变明显 [2]郑礼,高振强,王淑仙.大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究[J].中国药理学通 报,1998,14(4):370. [3]stroberw,Fuss I J,Blumberg RS.The immunology of mucosal models of inflam— rnationFJ].Amu Rev Immunol,2002,20:495—549. E43周静平,邓长生.罗格列酮对大鼠溃疡性结肠炎的疗效及其机制[J].临床消化 病杂志,2006i.18(2):84-86. E52张永锋,陈如山,吴正治,等.益气、活血、健脾、补肾代表方对小鼠实验性结肠 炎的防治作用仁[J].中药药理与临床,2006;22(2):9-22. E61 2E迎新,邹伟,刘成德,等.肠炎宁合剂对溃疡性结肠炎治疗作用的实验研究I-J7. 中医药信息,2O04,21(6):44-46. 好转,肠壁损伤修复,炎性细胞浸润减少,溃疡附近肠黏 膜可见不连续粘液层覆盖,而黏膜下层则可见胶原纤维增 (本文校对:张文娟收稿日期:2013一【)1—21) 实验室中有害气体苯、甲苯、甲醇和丙酮的检测分析 朱欣瑶赛永竹张晓静孙毅坤 (北京中医药大学中药学院,北京100102) 摘要:目的采用气相色谱法检测实验室空气中苯,甲苯,甲醇和丙酮的含量。方法在每个月的上中下旬个选择一天,以DMF (N,N- ̄--甲基甲酰胺)为吸收剂,采用气泡吸收管收集实验室内空气,气相色谱法测定(DM-WAX毛细管柱,FID检测器)。结果 实验室中苯,甲苯,甲醇和丙酮分离良好,苯加标回收率为97.88%,甲苯加标回收率为98.73%,甲醇加标回收率为98.99%,标回 收率为97.08%,相对标准偏差苯为0.81%,甲苯为0 72%,甲醇为0.67%,丙酮为0.06%。苯检出限7.19X10~mg/ml,甲苯检出 限7.2x10" mg/n ̄,甲醇检出限为8.78x10- mg/n ̄,丙酮检出限为8.39X10- mg/mi。结论高,适合实验室中苯,甲苯,甲醇,丙酮的检测。 该法简便,快速,重现性好,灵敏度 关键词:苯;甲苯;甲醇;丙酮;气相色谱法 doi:10.3969/j.issr ̄1672—2779.2013.04.110 文章编号:1672—2779(2O13)一04-0157-04 uene、MethanoI and Acetone Irl Laboratory The Analysis and Oetection of HarmfuI Gas Benzene、 ZHU Xinyao SAZ Yongzhu ZHANG X ̄ojine SUN Yikun 咖暂Univer ̄ty ofChinese Medicine School ofChinese materia medica,Be ̄ine 100102,China) Abstract:Objective We adopt gas chromatography to detect contents of benzene,toluene,methanol,acetone in laboratory.Methods In the early,middle and late in each month,this expenment selects a day,using DMF(N,N-dimethyl forrnamide)absorption,bubble absorption tube to collect the air in the laboratory,Gas Chromatography get the results(the DM-WAX capillary column material,the FID detector).Re- suits In the laboratory benzene.toluene methanol and acetone separation are good.Benzene recovery was 97.88%,toluene rccovcry WaS 98.73%,methanol recovery vcas 98.99%,acetone recovery WaS 97.08%,relative standard de ̄ation of benzene WaS 0.85%,toluene WaS 1.41%.methanolwas 0.67%,acetonewas 0.06%.I ̄lzene detectionlimitwas7 19×10" mg/r ̄,toluenedetectionlimit啷7.2×10- mg/ ml,methanol dctcctionlimitwaS 8.78x10- mg/mi,acetonedetectionliit"mwas 8.39x10-”mg/n ̄Themethodis simple,fast,good reproduc- ibility,high sensitivity,smtable for the detection of benzene,toluenc in the laoratbory. Key words:Benzene;Toluene;Methano1;Acetone;Gas chromatography 近年来,随着科学技术的飞速发展,国家越来越重 视对科研性人才的培养。实验室是进行科学研究、培养 专业人才的重要场所,由于研究的需要,实验中要接触 性质各异的样品和化学试剂,从而在一定程度上造成实 统,严重可导致白血病和癌症。甲苯是低毒物质,对中枢 神经系统有麻醉作用,会影响神经行为功能。甲醇[1 有毒, 对血管有麻痹作用及导致神经变性作用,可损害视神经。 丙酮嘲有微毒性,对神经系统有麻痹作用,并对黏膜有刺 激作用。本院研究生实验室经常用到上述化学试剂,但对 其在实验室空气中的含量缺少检测数据,本研究有针对地 选择几个特定实验室频繁使用化学试剂的时间段,采用气 验室空气的污染。苯的毒性很大,会损害机体的造血系 *通讯作者 

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