《上海畜牧兽医通讯》２０１４年第４期 ・ ６１ ・ 猪伪狂犬病油乳剂灭活疫苗免疫效力试验 潘 洁 何锡忠 张婉华 倪建平 张春玲 蒋凤英 李春华 徐伟林。 彭丽英¨ （１上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海佳牧生物制品有限公司 上海２０１１０６ ２上海科立特农科（集团）有限公司 上海２０１１０６） 伪狂犬病（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ，ＰＲ）是猪疱疹病毒Ｉ 型引起的一种或多种家畜感染的急性传染病，其特 征为发热、奇痒及脑脊髓炎 ，可引起妊娠母猪繁殖 障碍、流产、死胎、呼吸症状。仔猪死亡率较高，成 年猪常为隐性感染。临床症状主要表现为腹泻、呕 吐、生长不良等。在自然条件下，猪、牛、绵羊、犬、 猫、兔、鼠等及多种野生动物都能感染发病。猪既 是本病原的原发感染宿主，又是病毒的长期贮存者 和排毒者，在伪狂犬病的传播上起着重要作用 。 从２０１０年开始猪伪狂犬病的发病趋势不断上升，在 我国多个省市都有该病发生的报道。我们将近年 来从不同省市分离的流行毒株制备成灭活苗免疫 小鼠，比较不同猪伪狂犬病油乳剂灭活疫苗的免疫 效力。结果报告如下： １材料与方法 １．１ 试验材料 ＰＲＶ标准毒株由本实验室保存 ；分离毒１、 分离毒２、分离毒３、分离毒４配制的猪伪狂犬病灭 活疫苗由本实验室自制，分别称１号疫苗、２号疫 苗、３号疫苗、４号疫苗；试验用小鼠购自上海复旦 大学实验动物科学部。 １．２ 小鼠ＬＤ 。的测定 取ＳＰＦ昆明小鼠２Ｏ只分为５组，每组４只。 将ＰＲＶ标准毒株用ＤＭＥＭ作连续１Ｏ倍稀释。用 １０ ～１０ ４个稀释度的病毒液分别皮下注射于小 鼠，１００ ｆｆＬ／只，同时设对照组４只，接种后每日观察 症状，共观察１４ ｄ，记录死亡数和存活数，按常规方 法计算ＬＤ 。。 ，备攻毒使用。 １．３ 小鼠效力试验 取１３０只１０￣２２ ｇ ＳＰＦ昆明小鼠，将试验小鼠 分为８组，第１组（２０只）免疫１号疫苗，第２组（２０ 只）免疫２号疫苗，第３组（２０只）免疫３号疫苗， ＊为通讯作者 基金项目：上海市科委产业化项目（１１ＤＺ１９３０４００）资助 第４组（５只）为对照组１，第５组（２０只）免疫１号 疫苗，第６组（２０只）免疫２号疫苗，第７组（２０只） 免疫４号疫苗，第８组（５只）为对照组２，免疫 ３００ Ｌ／只，一免后１４ ｄ进行二免，二免１４ ｄ后攻 毒。第１～４组用１ ０００ ＬＤ 。ＰＲＶ标准毒株攻毒， ２００ ｆｆＬ／只；第５～８组用１００ ＬＤ 。ＰＲＶ标准毒株攻 毒，２００ Ｌ／只。各组试验小鼠单独饲养，每次免疫 后观察小鼠的临床表现及接种部位的状况。攻毒 后观察小鼠的临床表现，记录死亡数并计算保护 率，共观察１０ ｄ。 ２结果与分析 ２．１ 标准毒株对小鼠ＬＤ 。的测定 试验记录见表１，按常规方法计算标准毒株对 小鼠的毒价，结果ＬＤ 。为４．２５。 表１标准毒株对小鼠ＬＤ５。的测定结果 （单位：只） 组别 １０ １０ １０ １０一 对照 小鼠数量 ４ ４ ４ ４ ４ 死亡小鼠数 ４ ４ ２ １ ０ 未死亡小鼠数０ ０ ２ ３ ４ ２．２ 不同疫苗对小鼠的免疫效力试验 ２次免疫后小鼠均无猪伪狂犬病的临床症状， 接种部位无不良反应。用１０００ ＬＤ 。进行攻毒后，１ 号疫苗免疫小鼠４８ ｈ死亡２只，７２ ｈ死亡４只， ９６ ｈ死亡４只，２４０ ｈ死亡２只，共计１２只，１号疫 苗保护率为４Ｏ ；２号疫苗免疫小鼠７２ ｈ死亡１ 只，９６ ｈ死亡３只，１６８ ｈ死亡２只，２４０ ｈ死亡２ 只，共计８只，２号疫苗保护率为６Ｏ ；３号疫苗免 疫小鼠４８ ｈ死亡８只，７２ ｈ死亡８只，９６ ｈ死亡２ 只，共计１８只，３号疫苗保护率为１Ｏ ；对照组攻毒 后４８ ｈ内小鼠全部死亡，保护率为０。用１００ ＬＤ 。 进行攻毒后观察１０ ｄ小鼠进食正常，也无其他不良 反应出现，１号疫苗、２号疫苗和４号疫苗死亡率都 为０，保护率达１００ ；而对照组小鼠４８ ｈ左右开始 撕咬，被毛粗乱，７２ ｈ内全部死亡，保护率为０。 （下转第６３页） 《上海畜牧兽医通讯》２０１４年第４期 ・ ６３ ・ ５ ３ 讨论 平衡盐和营养成分以外的药品，包括抗菌药。因为 在进行该测定时，病毒会被逐级稀释，后面的稀释 孑Ｌ内可能只会有１个，甚至没有病毒，这就是病毒有 无的１个临界点。在这种情况下，本来对该病毒不 敏感的药品或抗生素，此刻所产生的作用就很难说 了。完全有这种可能，即在这种临界点下，单个病 毒未必能抵抗高浓度的抗生素或者其他药物。 ３．１ 超声波破碎细胞的意义 ＢＨＫ－２１细胞在接种蓝舌病病毒后，在ＭＥＭ 维持液里会产生很高的病毒滴度，这些病毒都是在 ＢＨＫ一２１细胞内不断地复制，然后随着细胞的崩解 而释放到维持液里的，在已经病变但还没崩解的细 胞内部，病毒的浓度更是高得多，只有通过反复冻 融或超声波破碎，才能让里面的病毒释放出来。否 则测出来的毒价会偏低。 ３．４ 关于ＴＣＩＤ 。的判定时间 ＴＣＩＤ 。的判定时间应该建立在阴性对照细胞 ３．２ 关于选用１０ ｍｇ／Ｌ乙基环丙沙星作为 研究浓度的依据 任何一种成分，哪怕是机体必需的，都不能超 过一定的浓度；否则必然引起相应的反应，甚至死 亡。培养细胞也一样，必需的营养超过了一定的限 度只会适得其反。同样培养病毒也是一个道理，营 养成分、抗污染成分只有在适合的浓度下，才能发 挥出其最佳效能。乙基环丙沙星在抑菌和抗支原 的正常生长状态之上，如果对照细胞在３７℃下只能 够维持７ ｄ，那么判定时间定为大于等于７ ｄ毫无意 义。所以，所测毒价只是作为横向比较，不作其他 依据，或者说它的其他对照也是采用相同处理时， 可以不用太拘泥于某些标准。 参考文献 ［１］贵州农学院．生物统计附实验设计［Ｍ］．北京：农业出版 社，１９９７：９５～９７． 体上有出色表现，但也不是越多越好，为拓展其运 用范围，高林等将其试用于细胞培养，并成功地找 到一个既不影响细胞生长又能抑制细菌和支原体 的浓度一一ｌＯ ｍｇ／Ｌ ，但该浓度是否会抑制病 毒在细胞中的增殖，未见相关报道。 ［２］高林，廖德芳，姚俊，等．用乙基环丙沙星重建受猪鼻支 原体污染的ＢＨＫ一２１细胞的研究［Ｊ３．中国畜牧兽医， ２ｏ１１，３８（１２）：４５～４９． ［３］高林，廖德芳，姚俊，等，用乙基环丙沙星重建受大肠杆 菌污染的ＢＨＫ－２１细胞［Ｊ］．中国畜牧兽医，２０１１，３８ （１１）：２１４～２１７． ３．３ 关于ＴＣＩＤ 。测定 本人认为，在进行ＴＣＩＤ 。测定时不能加其它除 （上接第６１页） 表２不同疫苗对小鼠的免疫原性 （单位：只、 ） ［４］ＧＢ／Ｔ １８６３６—２００２，蓝舌病诊断技术［Ｓ］． 免疫，２８ ｄ后攻毒初步测定结果表明：１号疫苗、２ 号疫苗和３号疫苗用１ ０００ ＬＤ 。进行攻毒保护率分 别为４０ ９／６、６Ｏ 和１Ｏ ，１号疫苗、２号疫苗和４号 疫苗三种免疫小鼠用１００ＬＤ 。进行攻毒保护率均达 到１００ 。证明１号疫苗、２号疫苗和４号疫苗具有 良好的免疫效果。这为今后猪伪狂犬病疫苗的研 究奠定了基础。 １ＯＯ １０Ｏ １００ Ｏ 参考文献 ［１］殷震，刘景华．动物病毒学（第二版）［Ｍ］．北京：科学出版 社，１９９７． ３ 结论 采用不同疫苗接种于昆明小白鼠后无不良反 应，表明４种疫苗都有良好的安全性。在兽用生物 制品质量标准汇编（２０１１）中猪伪狂犬病油乳剂灭 ［２］陈焕春，金梅林，王厚钰，等．从母猪暴发产死胎中分离 伪狂犬病病毒［Ｊ］．华中农业大学学报，１９９２，１０（４）： ３９０～３９１． ［３］何启盖，陈焕春，方六荣，等．猪伪狂犬病病毒双基因缺 失突变株（ＨＢ－９８株）安全性、稳定性和免疫原性测定 ［Ｊ］．中国兽医学报，２００６，３（２６）：１６５～１６８． 活疫苗的效力试验要求：小鼠首免１５ ｄ后进行二次 免疫，３００ Ｌ／只，免疫３０ ｄ后，每只用２００ Ｌ ＰＲＶ ５０ＬＤ 。进行攻毒，保护率达７０ 就确定此疫苗可以 对猪达到足够的保护效力 。本试验用相同的剂量 ［４］中国兽医药品监察所农业部兽药评审中心．兽用生物制 品质量标准汇编［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２０１１．
