黄瓜全雌性基因连锁的AFLP和SCAR分子标记

娄群峰　陈劲枫

14853,美国)

1

13

　MollyJahn　陈龙正　耿　红　罗向东

2

2111

(1作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京农业大学园艺学院,南京210095;康乃尔大学育种系,伊萨卡,纽约

摘　要:本研究以全雌品种‘戴多星’自交系和弱雌品种‘北京截头’自交系为双亲杂交获得F1,然后得到F2性型分离群体,利用分离群体分组分析法(BulkedSegregantAnalysis,BSA)构建全雌和弱雌两个基因池,筛选了对AFLP选择性引物EcoRI2NN+MseI2NNN组合,发现EcoRI2TG+MseI2CAC引物组合在全雌基因池中扩增出一条分子量为234bp的特异带。经F2代单株验证,该特异条带能在全雌单株中稳定出现。以MAPMAKER(Version310)软件分析,该标记与全雌性位点的连锁距离在617cM。命名该连锁标记为TG/CAC234。将该特异条带回收、克隆、测序,设计特异SCAR引物,再对F2代单株基因组DNA进行扩增,仅在全雌单株中扩增出1条分子量为166bp的特异带,表明已成功地将与黄瓜全雌性连锁的AFLP标记转化为操作简便、表现稳定的SCAR标记,该标记命名为SA166。关键词:黄瓜;全雌性;分子标记;AFLP;SCAR中图分类号:S212　　文献标识码:A　　文章编号:05132353X(2005)0220256206

IdentificationofAFLPandSCARMolecularMarkersLinkedtoGynoeciousLociinCucumissativusL.

LouQunfeng,ChenJinfeng,MollyJahn,ChenLongzheng,GengHong,andLuoXiangdong

Nanjing210095,China;

2

1132111

(1StateKeyLaboratoryofCropGeneticsandGermplasmEnhancement,CollegeofHorticulture,NanjingAgriculturalUniversity,

DepartmentofPlantBreeding,CornellUniversity,Ithaca,NY14853,USA)

Abstract:Gynoecyplaysanimportantroleincucumber(CucumissativusL.)heterosisbreedingandidentificationofthemarkerslinkedtothischaracterwillfacilitateselectionofgynoeciouscucumberlineinbreedingprogram.Inthepresentstudy,selfedgynoeciouscucumber‘DeltaStar’andmonoeciouscucumber‘BeijingJietou’wereusedasparentstomakeF1andthenselfedtobuildF2sexsegregatedpopulation.Gyno2eciousandmonoeciousDNApoolsweredevelopedseparatelyusingbulkedsegregantanalysis(BSA).Ampli2fiedfragmentlengthpolymorphism(AFLP)techniquewithprimercombinationswereemployedtofindthepolymorphismsbetweenbothDNApools,andingyneociousDNApoola234bpspecificfragmentwasampli2fiedintheprimercombinationofTG+CAC.ThismarkerwastestifiedwithindividualDNAoftheF2popula2tionandthebandcouldonlybeamplifiedinthegynoeciousplants.LinkageanalysisusingthesoftwareofMAPMAKER(version310)indicateditsgeneticdistancetothegynoeciouslociwas617cM,andthisAFLPmarkerwasdesignedasTG/CAC234.Thisbandwascollectedandsequencedtosynthesizeasequence2charac2terizedamplifiedregion(SCAR)primer.TheprimerwasusedtoamplifytheindividualDNAsoftheF2popu2lationandobtainedaspecificbandof166bpinthegynoeciousplants,indicatingasuccessfulconversionoftheSCARmarkerfromAFLPone.ThisSCARmarkerwasdesignedasSA166,andhasbeenpracticallyusefultothemarker2assistedselectioninourcucumberbreedingprogram.

Keywords:Cucumber(CucumissativusL.);Gyneocious;Molecularmarker;AFLP;SCAR

收稿日期:2004-06-07;修回日期:2004-07-26基金项目:上海市科技兴农重点攻关项目(20012323;2003D22121);国家自然科学基金项目(30470120);国家高技术研究发展计划专项

(2002AA241251;2004AA241120)

3通讯作者Authorforcorrespondence

　2期

娄群峰等:黄瓜全雌性基因连锁的AFLP和SCAR分子标记　257

黄瓜(CucumissativusL.)是重要的设施栽培作物,其雌花率的高低直接影响到产量的多少。目前设施栽培优良的黄瓜品种都具备全雌性或强雌性特征。全雌性是黄瓜优势育种的重要途径。但由于黄瓜性别表现受到遗传和环境等多种因素的影响,应用传统的方法,从表型上进行全雌性基因的选择效率不高,给全雌性的有效利用带来困难。应用与目的基因相连锁的分子标记进行辅助育种能直接从基因型上对后代单株进行选择,提高准确率,从而大大地提高育种效率。

目前,与植物性别决定基因连锁的分子标记研究主要集中在雌雄异株植物中,如大麻(Cannibis

〔3〕〔4〕

、石柏(AsparagusofficinalisL.)、银杏(GinkgobilobaL.)等。相比之下黄瓜性

别表现更为复杂,除雌雄异花同株外,还有全雌株、两性株、雄花两性花同株,雄花、雌花及两性花

sativasL.)

〔1,2〕

同株等类型。黄瓜全雌性状被认为主要由F基因控制,同时还受到隐性gy基因和一些修饰基因的作

〔5,6〕用。迄今,有关黄瓜性别决定相关基因的分子标记研究较少。已构建的少数黄瓜分子标记连锁图

〔7〕

谱将F基因进行了定位,如Fazio等发表的连锁图上与F基因最近的为510cM的1个SSR标记。

〔7～9〕

然而,在这些连锁图上,对F位点贡献率的解释有所差异。因此,目前能用于黄瓜全雌性辅助育种实践的分子标记仍不多见。

、性状连锁标记的筛选、亲缘关系的分

〔14〕

析等工作。本研究利用AFLP技术,研究与黄瓜全雌性状连锁的标记,希望获得连锁紧密的AFLP标记,以实现黄瓜全雌性状的标记辅助育种,加速我国黄瓜全雌性品种的选育进程。

AFLP标记技术现已普遍地用于图谱的构建〔10,11〕

〔12,13〕

1　材料与方法

111　植物材料和性型分离群体的构建

亲本1:CC3,华北型黄瓜品种‘北京截头’(来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所,编号为

V05A4)的8代自交后代。雌花率在20%以下,为纯合弱雌;果皮多刺。

亲本2:EC1,欧洲雌性系‘戴多星’(来源于RIJKZWAAN公司)的6代自交后代。未见出现雄花的单株,为纯合全雌;果皮光滑。

利用CC3和EC1的正反交F1、F2代和以CC3为回交亲本的BC1代作性型遗传分析,分离比例以卡方测验进行显著性分析。各代的性型统计以全株上下均为雌花,无1朵雄花为全雌性;主茎20节内雌花与雄花比例大于50%为强雌性;小于或等于50%的为弱雌性。

利用F2代群体进行AFLP分子标记研究。F1代的全雌单株自交时,利用300mg/kg的银水溶液于3～4片叶龄进行叶面喷施,每隔3d喷施1次,共喷施2次。诱导出雄花后进行单株隔离授粉。

112　AFLP研究方法

的方法。其中条带的显示采用银染法。部分步骤略有修改。

〔16〕

11211　基因组DNA的提取和DNA池的构建　基因组DNA提取采用CTAB法。利用琼脂糖凝胶电

〔17〕

泳和溴化乙淀显色进行DNA浓度的定量。F2单株DNA提取后,利用BSA法各取10个全雌和弱雌单株DNA等量混合,构建成全雌和弱雌DNA池用于AFLP引物的多态性筛选。11212　酶切和接头的连接　取015μg基因组DNA,采用EcoRI和MseI进行双酶切。酶切后与EcoRI

AFLP研究主要参考Vos等

〔15〕

和MseI接头连接。EcoRI接头:5π2CTCGTAGACTGCGTACC23π,3π2CATCTGACGCATGGTTAA25π;MseI接头:5π2GACGATGAGTCCTGA23π,3π2TACTCAGGACTCAT25π。11213　酶切连接产物的扩增　取5μL酶切连接产物为模板进行预扩增。预扩增程序为:94℃1min,56℃1min,72℃1min,36个循环;72℃延伸7min。

预扩增产物1∶30稀释,作为选择性扩增的模板。选择性引物组合共对,由8个带2个选择性碱基的EcoRI2NN引物,和8个带3个选择性碱基的MseI2NNN引物组成。选择性扩增程序为:94℃预变性30s;94℃30s,65℃30s,72℃120s,然后每个循环退火温度降低017℃,经13个循环后,

258园　　艺　　学　　报

表1　AFLP预扩增和选择性扩增引物序列

32卷

退火温度降至56℃;再进行23个循环的扩增:

94℃30s,56℃30s,72℃120s。

扩增反应在PTC2100PCR仪上进行。所用预扩增和选择性扩增引物序列见表1。11214　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳　选择性扩增产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶(6%丙烯酰胺,

-1

0132%甲叉丙烯酰胺,7mol・L尿素,1×TBE)中电泳分离。电泳缓冲液为1×TBE,恒功率60W预电泳30min后,将扩增产物加入等

-1

体积的上样缓冲液(98%甲酰胺,10mmol・LEDTA,0125%溴酚蓝),95℃变性5min后,立即转移至冰浴中冷却,然后每个样品取8μL上样,60W电泳2～3h。

11215　银染　电泳后,小心分开两块玻璃板,将Table1　Pre2amplificationandselectiveamplificationprimer

sequencesusedinAFLP预扩增引物3

PrimersforpreamplificationE00

选择性引物

Primersforselectiveamplification

M00

附着凝胶的长玻璃板放入10%冰醋酸中固定303CTGAGTAA23π。min;再用去离子水漂洗2次,每次5min;然后转入染色液(2g银,3mL37%甲醛溶于2L去离子水)中染色30min,用2L去离子水快速漂洗5～6s,立即转入显影液(60g碳酸钠,3mL37%甲醛,400μL10%硫代硫酸钠溶于2L去离子水)中,轻摇至条带清晰后,加入等体积的10%冰醋酸停显,约10min后用去离子水漂洗干净。自

E2AA5π2GACTGCGTACCAATTCAA23’E2AG5π2GACTGCGTACCAATTCAG23πE2AC5π2GACTGCGTACCAATTCAC23πE2AT5π2GACTGCGTACCAATTCAT23πE2TA5π2GACTGCGTACCAATTCTA23πE2TG5π2GACTGCGTACCAATTCTG23πE2TC5π2GACTGCGTACCAATTCTC23πE2TT5π2GACTGCGTACCAATTCTT23πM2CAA5π2GATGAGTCCTGAGTAACAA23πM2CAG5π2GATGAGTCCTGAGTAACAG23M2CAC5π2GATGAGTCCTGAGTAACAC23πM2CAT5π2GATGAGTCCTGAGTAACAT23πM2CTA5π2GATGAGTCCTGAGTAACTA23πM2CTG5π2GATGAGTCCTGAGTAACTG23πM2CTC5π2GATGAGTCCTGAGTAACTC23πM2CTT5π2GATGAGTCCTGAGTAACTT23πE00:5π2GACTGCGTACCAATTC23π;M00:5π2GATGAGTC2

然干燥保存。

11216　连锁性分析　利用Mapmaker(version310)软件对F2代分离群体单株的标记和性型表现数据进行连锁分析,并利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距(cM)。113　特异条带的回收克隆及SCAR标记的转化

对连锁标记进行条带的回收。以灭菌的解剖刀准确切下多态条带,转入装有200μL重蒸水的离

-1

心管中。置于沸水浴中15min,然后12000r・min离心10min。取5μL上清液作为模板再次以相应引物组合,相同条件进行扩增。扩增产物经测序胶电泳验证分子量后,克隆于pGEM2Teasy载体上,单菌落质粒提取后,经酶切鉴定,由上海博亚生物技术有限公司进行DNA测序。

根据测序后去除接头的全序列,利用PrimerPremier510软件设计SCAR引物,由上海博亚生物技术有限公司合成引物。以F2代单株的基因组DNA验证SCAR引物的特异性。SCAR2PCR扩增体系20μL,其中包含10×Buffer2μL,MgCL2115mmol・LL

-1

-1

〔18〕

,dNTP150μmol・L

-1

,引物015μmol・

,基因组DNA约50ng,TaqDNA聚合酶1U。扩增程序为:94℃预变性5min;94℃1min,63℃

1min,72℃2min,30个循环;最后在72℃下延伸7min。

2　结果与分析

211　利用分离群体进行黄瓜全雌性遗传规律分析

以全雌性EC1和弱雌性CC3为亲本进行正反交获得F1代。共观察F1代单株54株,均表现全雌性,全株上下无一朵雄花,说明黄瓜全雌性对弱雌性为完全显性,由核基因控制。对BC1和F2代群体单株的性型统计表明,BC1代群体共有98株,其中53株全雌性,45株弱雌株。经X测验,BC1代全雌与弱雌株比例完全符合1∶1的分离比(P值为0125～015,大于0105),表明黄瓜全雌性状由单显性基因控制。同时对F2代共166个单株的性型统计表明,其中全雌性67株、强雌性57株、弱雌性42株。理论上来说,F2代单株性型表现应该为两种类型,即全雌型和弱雌型。但在本试验中,F2代群体也有出现少量雄花的强雌性株,可能是雌性表现受到环境条件的影响,产生少量雄花,因

2

　2期

娄群峰等:黄瓜全雌性基因连锁的AFLP和SCAR分子标记　

2

259

此统计时将全雌株和强雌株合并作为雌性株,经X测验,F2代雌性株与弱雌株分离比例完全符合3∶1的比例(P值=1,大于0105),也表明黄瓜全雌性状由单显性基因控制。212　AFLP引物在全雌和弱雌DNA池间的多态性

采用对AFLP引物组合对分别由10个单株混合组成的全雌和弱雌DNA池进行扩增,生约4250条带,每对引物平均扩增出约70条带。筛选出在全雌和弱雌DNA池间表现多态的标记共5个,EcoRI2NN/MseI2NNN分别为AA/CAT142、AG/CAC350、AT/CTC260、TA/CTG263、TG/CAC234。213　多态性标记在F2代单株中的检测及连锁距离的确定

利用上述具有多态带的5个引物组合对F2代单株进行PCR验证。结果发现,其中TG/CAC234与全雌性表型存在连锁关系,绝大多数全雌单株中出现该条带,而雌雄异花同株单株中则未见该标记(图1)。所用F2代单株共有全雌性38株,雌雄异花同株42株。标记检测表明其中全雌单株中有34株出现该标记,4株未见该标记。雌雄异花同株单株中,有3株未出现该标记,39株出现该标记。利用Mapmaker(version310)计算出标记与全雌性位点的连锁距离在617cM,连锁较为紧密。

图1　E2TG和M2CAC引物组合扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

1～10:全雌性单株;11～20:雌雄异花同株单株;M:pBR322DNA/AluI分子量标准。箭头示全雌性单株中出现的特异带。

Fig.1　ThePAGEelectrophoresisresultsofselectiveamplificationwithprimercombinationE2TGandM2CAC

1-10:individualgynoeciousplants;11-20:individualmonoeciousplants;M:pBR322DNA/AluImarker.

Thearrowshowingthespecificbandfromgynoeciousplants.

214　AFLP标记转化为SCAR标记

对该连锁标记进行回收、克隆、测序,序列如图2所示,全长共234bp。去除接头部分序列后,

所得特异片段长度为200bp(图2)。根据PrimerPremier510软件设计SCAR引物。上下游引物位置为第3～24和第143～168个碱基,扩增产物长度为166个碱基。引物SA1序列为:5π2CAAAATGTC2CTATGACTGGTAA23π,SA2序列为:5π2CATATTGATCACAATGTTCTTAAA23π。

图2　全雌性特异标记TG/CAC234全序列

黑体为AFLP引物TG/CAC序列;带下划线的序列为SCAR特异引物SA166

Fig.2　DNAsequenceoftheAFLPfragmentTG/CAC234

ThesequenceinboldisthesequenceoftheAFLPprimerTG/CAC;TheunderlinedisthesequenceofthespecificprimersSA166

利用所设计的特异引物对F2代单株的基因组DNA进行扩增鉴定。结果经琼脂糖电泳检测表明,在全雌单株中扩增出166bp长的片段,而在雌雄异花同株单株中则未见该标记(图3),表明已成功地将该AFLP标记转化为SCAR标记。并将该SCAR标记命名为SA166。

260园　　艺　　学　　报32卷

图3　SCAR标记SA166在F2代单株中的扩增结果

1～8为全雌株;9～16为雌雄异花同株;M为pBR322DNA/AluI分子量标准;箭头示特异带位置。Fig.3　AmplificationfortheindividualplantsofF2populationwiththespecificprimersSA1661-8:individualgynoeciousplants;9-16:individualmonoeciousplants;M:pBR322DNA/AluImarker.

Thearrowshowingthespecificbandfromgynoeciousplants.

3　讨论

我国在黄瓜全雌性基础理论研究和全雌性品种选育方面虽有过一些报道,但与欧美等发达国家相

比仍存在较大的差距。目前,我国大型温室中栽培的黄瓜品种多为进口的全雌性单性结实品种,春夏栽培全雌性状表现稳定。而国产相关优良品种较少,已有的强雌性品种其雌花率常常随栽培季节的变化而变化。本试验利用AFLP标记结合银染技术获得了与黄瓜全雌性位点连锁距离为617cM的标记,并成功地将其转化成操作简便、表现稳定的SCAR标记。这是目前国内首次报道的与黄瓜全雌性基因位点紧密连锁的分子标记,该标记能在苗期对黄瓜全雌性单株进行有效的选择,这对黄瓜全雌性品种的辅助选育具有重要的实践意义。

黄瓜性别表现被认为主要受到两个主效基因m和F相互作用的影响。F基因能加速植物的性转变过程,决定雌性化的程度(FF>Ff>ff),即FF为全雌性,Ff为强雌性,ff为弱雌性;M基因控制黄瓜植株性别是单性花(基因型为M_)或两性花(基因型为mm),纯雌株型基因型为M_〔19～21〕FF。而F基因又受到In2F(F增强基因)和其它一些基因的修饰。在最近构建的的黄瓜分子标记连锁图中,有3个与性别表达相关的位点被定位,分别为第1连锁群上的sex111(F)、sex112(de)和第6连锁群上的sex611(AT1222SCAR),在后代中,当这3个位点均存在时,表现出强烈的雌性特点。在本研究中,与TG/CAC234标记连锁的雌性基因对黄瓜全雌性表型具有决定作用,即该基因存在时即表现全雌性,否则表现雌雄同株。因此,与TG/CAC234标记连锁的雌性基因可能是一个决定全雌性的关键性基因,但其是否为F基因则需要进一步的验证。参考文献:

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